嗜酸性粒细胞作为非小细胞肺癌抗PD-1单药治疗疗效预测生物标志物的临床与免疫机制研究

本研究发现，外周血嗜酸性粒细胞水平与非小细胞肺癌（NSCLC）患者接受抗PD-1单药治疗的疗效显著相关。高水平嗜酸性粒细胞（≥1.7%）与更长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关，且与效应记忆T细胞（EM）亚群及诱导性T细胞共刺激分子（ICOS）表达呈正相关。该研究提示嗜酸性粒细胞可作为预测免疫检查点抑制剂（ICI）疗效的潜在生物标志物，并为理解嗜酸性粒细胞在肿瘤免疫中的作用提供了新视角。

　　

1 引言

嗜酸性粒细胞在过敏性疾病如支气管哮喘的发病中发挥重要作用，通过释放特异性颗粒（如主要碱性蛋白MBP）、脂质介质和活性氧参与炎症过程。近年研究发现，嗜酸性粒细胞还可通过胞外诱捕网（EETosis）释放胞外DNA陷阱，加剧炎症反应。然而，嗜酸性粒细胞也具有维持稳态的多种功能，包括改善胰岛素抵抗、增强葡萄糖耐受以及通过维持脂肪组织替代活化巨噬细胞参与代谢稳态调节。小鼠研究表明嗜酸性粒细胞存在表型多样性，提示其功能可能因作用部位和环境而异。

肺癌是一种预后不良的恶性肿瘤，铂类化疗曾是晚期肺癌患者的标准治疗方案，但仅能延长数月生存期。免疫检查点抑制剂（ICI）的出现改变了癌症治疗格局，包括抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1拮抗性抗体。抗PD-1单药治疗可使约15%的晚期NSCLC患者生存超过5年。

嗜酸性粒细胞在癌症发展中的作用存在争议。在某些癌症类型中，嗜酸性粒细胞发挥抗肿瘤作用，而在肺腺癌等肿瘤中则可能促进肿瘤发展。最近研究发现，血液嗜酸性粒细胞计数与ICI疗效存在关联。在恶性淋巴瘤患者中，治疗前高嗜酸性粒细胞计数或治疗后早期升高与临床反应改善相关。NSCLC研究中也观察到类似现象，但其免疫学机制尚不明确。

2 方法

2.1 研究设计

研究纳入2016年2月至2019年3月期间在Saitama Medical University International Medical Center接受nivolumab（抗PD-1抗体）单药治疗的226例晚期NSCLC连续患者。入选标准包括：首次nivolumab给药前14天内可获得包括基线嗜酸性粒细胞计数的全血细胞计数；接受nivolumab作为二线或后线治疗并完成至少一个治疗周期；既往未接受过任何ICI治疗。排除缺乏必要基线临床或实验室数据的患者。

2.2 治疗

Nivolumab以3 mg/kg或240 mg/次每2周一次，或480 mg/次每4周一次静脉给药。

2.3 临床数据评估

治疗前根据计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）-CT结果进行基线肿瘤和反应评估，采用实体瘤反应评价标准（RECIST）1.1版。无进展生存期（PFS）定义为从nivolumab治疗开始到确认疾病进展或任何原因死亡的时间。总生存期（OS）定义为从nivolumab单药治疗开始到任何原因死亡（事件）或最后接触（截尾）的时间。

2.4 PBMC分析

按照先前研究方法，使用相同单克隆抗体和BD LSR Fortessa流式细胞仪进行细胞染色。通过Ficoll密度梯度离心分离PBMCs，使用FoxP3固定和破膜试剂盒进行细胞内染色制备。分析10,000个细胞/样本，使用FlowJo软件处理数据。重点表征外周CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群，包括幼稚、中央记忆和效应记忆区室分布。

2.5 统计分析

统计学显著性设定为P < 0.05。采用Cochran-Armitage趋势检验、Mann-Whitney U检验、Spearman等级相关、卡方检验、Fisher精确检验、Kruskal-Wallis检验和Steel多重比较检验分析嗜酸性粒细胞水平与临床特征的关系。

3 结果

3.1 患者选择与特征

最终纳入204例符合所有入选标准的患者，其中44例患者在获得额外同意后采集了PBMCs样本。中位年龄69岁（范围31-89岁），男性148例（72.5%），所有患者均接受nivolumab作为二线或后线治疗。

3.2 nivolumab给药后血液嗜酸性粒细胞水平变化

nivolumab单药治疗诱导所有治疗患者血液嗜酸性粒细胞计数（p = 0.0009）和嗜酸性粒细胞占白细胞百分比（p < 0.0001）显著增加。有吸烟史患者治疗前嗜酸性粒细胞计数（p = 0.018）和百分比（p = 0.026）高于无吸烟史患者。过敏性疾病的存在不影响治疗前嗜酸性粒细胞水平。

3.3 治疗前嗜酸性粒细胞水平与T细胞亚群的关系

PBMC分析显示，嗜酸性粒细胞百分比与CD4⁺ T细胞中效应记忆（EM）亚群百分比（相关系数 = 0.43, p = 0.0045）和CD8⁺ T细胞中EM亚群百分比（相关系数 = 0.35, p = 0.020）呈正相关。与CD4⁺幼稚T细胞亚群百分比呈负相关（相关系数 = -0.47, p = 0.0018）。诱导性T细胞共刺激分子（ICOS）阳性CD8⁺ T细胞百分比也与嗜酸性粒细胞百分比呈中等相关（相关系数 = 0.31, p = 0.043）。嗜酸性粒细胞百分比与Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞百分比无相关性。

3.4 外周嗜酸性粒细胞作为nivolumab单药治疗反应预测指标

获得部分缓解（PR）的患者表现出更高的治疗前嗜酸性粒细胞计数和百分比。嗜酸性粒细胞计数和百分比与nivolumab单药治疗后肿瘤大小变化呈负相关。ROC曲线分析确定区分疾病控制（CR+PR+SD）与疾病进展（PD）的临界值为≥1.7%（AUC = 0.608）。嗜酸性粒细胞增多组PFS（log-rank p = 0.014）和OS（log-rank p = 0.001）显著长于非嗜酸性粒细胞增多组。

3.5 血液嗜酸性粒细胞在有无EGFR/ALK驱动突变患者中预测预后的作用

在无驱动突变患者中，嗜酸性粒细胞增多组OS显著延长（log-rank p = 0.0064）。在EGFR/ALK驱动突变患者中，通过ROC分析确定更高的临界值（≥3.8%，AUC = 0.79），使用此临界值时，嗜酸性粒细胞增多组PFS延长（log-rank p = 0.0018）。

4 讨论

本研究发现在nivolumab单药治疗前较高的血液嗜酸性粒细胞水平或治疗后嗜酸性粒细胞计数的早期升高与更长的PFS和OS相关。血液嗜酸性粒细胞水平与CD4⁺和CD8⁺ T细胞中EM亚群比例以及CD8⁺ T细胞中ICOS细胞比例呈正相关，表明高血液嗜酸性粒细胞水平可能与T细胞活化相关。

PD-1阻断疗法通过抑制APC和肿瘤细胞上PD-L1与T细胞上PD-1的结合，激活CD8⁺ T细胞发挥抗肿瘤作用。CD4⁺ T细胞对于CD8⁺ T细胞的启动、克隆增殖、迁移侵袭能力和获得细胞杀伤功能至关重要。本研究结果显示血液嗜酸性粒细胞水平与Th2极化或过敏性疾病无关，而与EM T细胞亚群的上调相关。

EM细胞是记忆T细胞的亚群，在外周组织和血液中循环，遇到抗原时可通过产生大量细胞因子发挥效应功能。研究表明较高水平的EM T细胞与抗PD-1治疗更好的反应相关，且抗PD-1治疗可增加EM T细胞水平。嗜酸性粒细胞水平与CD8⁺ T细胞中ICOS表达呈正相关，ICOS在T细胞活化时表达增加，在T细胞分化和活化中起重要作用。

吸烟史导致治疗前血液嗜酸性粒细胞计数和百分比增加，这与既往研究一致。ICI治疗对有吸烟史患者更有效，可能与吸烟增加血液嗜酸性粒细胞水平从而改善nivolumab单药治疗后预后有关。

嗜酸性粒细胞参与肿瘤免疫的机制尚未完全阐明。肿瘤细胞产生IL-5、GM-CSF、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子-1，这些都参与嗜酸性粒细胞活化和迁移。1型细胞因子/趋化因子也可激活嗜酸性粒细胞。活化T细胞产生大量1型或2型细胞因子/趋化因子，可激活嗜酸性粒细胞并使其向肿瘤细胞迁移。

嗜酸性粒细胞在癌症发展中的作用存在争议。在宫颈癌、淋巴瘤和卵巢癌中提示嗜酸性粒细胞有促瘤作用，在肺腺癌中可能通过产生血管内皮生长因子和转化生长因子-β等促血管生成因子和生长因子发挥促瘤作用。而在结直肠癌、乳腺癌和胃癌中则提示有抗肿瘤作用，可能通过释放嗜酸性粒细胞特异性颗粒如MBP和蛋白酶如颗粒酶B发挥细胞毒性作用。

嗜酸性粒细胞还可能通过直接激活CD4⁺和CD8⁺ T细胞增强抗肿瘤 immunity。嗜酸性粒细胞可作为抗原呈递细胞，气道嗜酸性粒细胞诱导T细胞增殖和细胞因子产生。嗜酸性粒细胞产生和释放半胱氨酰白三烯（cysLTs）和半乳糖凝集素-10（Charcot-Leyden晶体），直接激活树突状细胞。抗IL-5治疗减少EM T细胞和CM T细胞频率，增加幼稚T细胞和Treg细胞频率，表明嗜酸性粒细胞可直接影响CD4⁺ T细胞亚群比例。

本研究存在一些局限性：单中心研究可能产生偏倚；男性主导（73%）可能引入性别相关的免疫反应偏倚；虽然发现嗜酸性粒细胞水平在EGFR/ALK突变NSCLC中的预测潜力，但因样本量有限和基线不平衡需谨慎解读；所有患者在开始nivolumab前已接受化疗或其他全身治疗，既往治疗可能影响循环免疫环境；未研究复合预测因子；未检测嗜酸性粒细胞功能。

总之，嗜酸性粒细胞水平升高可能指示T细胞 immunity活化，而非Th2介导的反应极化。治疗前较高的血液嗜酸性粒细胞水平或治疗后早期嗜酸性粒细胞计数升高提示抗PD-1治疗在NSCLC中具有更好疗效，至少在二线或后线治疗中如此。