基于单细胞转录组构建结直肠癌肝转移预后模型及MIF通路调控机制研究

本综述基于单细胞与批量RNA测序数据，系统解析结直肠癌肝转移进程中上皮细胞基因表达动态（如TPM2、RPS17、TNNT1上调和SPINK4下调），构建多基因预后风险模型（Prognostic Model），并揭示MIF-CD74/CXCR4信号轴在促进肿瘤转移中的关键作用，为靶向治疗提供新策略。

　　

引言

结直肠癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，肝转移是其预后不良的主要因素。研究表明，非转移性结直肠癌患者五年生存率约为60%，而伴随肝转移的IV期患者骤降至12%。当前治疗策略强调基于分子特征的个性化靶向治疗，如抗表皮生长因子受体（anti-EGFR）和抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）抗体，但耐药和转移机制仍未完全阐明。因此，深入探索结直肠癌肝转移的分子机制及开发新型预后模型具有重要意义。

材料与方法

研究从GEO和TCGA数据库获取结直肠癌样本的单细胞转录组（scRNA-seq）和批量RNA测序数据，聚焦上皮细胞在转移过程中的基因和通路变化。利用Seurat软件进行质量控制、标准化和聚类分析，通过Harmony包消除批次效应，并采用Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因（DEGs）。功能富集分析使用clusterProfiler进行GO和KEGG通路注释。预后模型基于Cox比例风险回归构建，并通过TCGA（训练集，n=515）和GEO（验证集，n=127）队列验证。单细胞轨迹分析借助Monocle2完成，细胞通讯网络通过CellChat解析。实验验证部分包括10例患者肿瘤样本的Western blot和免疫组化（IHC）染色，抗体针对SPINK4、RPS17、TNNT1和TPM2。

结果

单细胞图谱与细胞谱系注释

UMAP聚类识别出16个细胞簇，注释为上皮细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、浆细胞、成纤维细胞和肥大细胞7大类。上皮细胞和T细胞在样本中占比最高，且从非转移性结直肠癌（CRC）到肝转移（LM）过程中，T细胞比例逐渐上升，上皮细胞和B细胞下降，提示免疫微环境在转移中扮演重要角色。

预后风险模型揭示四基因特征

上皮细胞中鉴定出243个DEGs，其中15个与预后显著相关。多变量Cox回归最终筛选出TPM2、RPS17、TNNT1和SPINK4构建风险评分（RS）模型：

RS = (0.1638 × TPM2) + (0.1980 × RPS17) + (0.1401 × TNNT1) + (-0.0845 × SPINK4)。

训练集和验证集中，高风险组总生存期显著缩短（p<0.001），ROC曲线下面积（AUC）在1、3、5年预测中均高于0.65，表明模型具有良好的预测效能。Nomogram整合年龄、分期和RS评分，校准曲线显示预测与实际生存率高度一致。

实验验证基因表达差异

Western blot和IHC证实，在肝转移样本（CRCM）中，TPM2、RPS17和TNNT1蛋白表达显著上调，SPINK4下调。其中TNNT1差异最显著（p<0.05），TPM2和SPINK4趋势一致但未达统计显著性，可能与样本量较小有关。

伪时间轨迹追踪基因动态

上皮细胞轨迹分析显示，状态1和2对应非转移性细胞，状态3包含转移与非转移细胞。沿伪时间进程，TPM2、RPS17和TNNT1表达持续上升，SPINK4先升高后急剧下降，提示这些基因在转移演进中动态调控。

拷贝数变异与染色体异常

上皮细胞中染色体6、7和20显示显著拷贝数变异（CNV），可能与癌基因扩增或抑癌基因缺失相关，如7号染色体增益常见于结直肠癌进展。

细胞通讯揭示MIF通路核心作用

CellChat分析发现，转移样本中上皮细胞和成纤维细胞的通讯强度显著增强，其中MIF-CD74+CXCR4配体-受体对最为突出。上皮细胞和成纤维细胞作为MIF主要来源，与B细胞、T细胞和巨噬细胞上的CD74/CXCR4相互作用，激活炎症和免疫调节通路（如CXCL、TNF和补体通路），促进肿瘤血管生成和转移。蛋白互作（PPI）网络进一步确认CD74为核心节点。

讨论

研究通过整合多组学数据与实验验证，阐明结直肠癌肝转移过程中上皮细胞基因表达谱的演变特征。TPM2、RPS17和TNNT1的上调可能通过调节细胞骨架动态（如TPM2与肌动蛋白互作）、促进上皮-间质转化（EMT）和细胞周期加速（如TNNT1激活p38/JNK和Wnt/β-catenin通路）驱动转移；SPINK4作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，其下调可能削弱细胞黏附、促进基质降解。MIF通路激活通过CD74/CXCR4介导的ERK或Src/PI3K信号级联，调控细胞骨架蛋白（如cofilin）和免疫微环境，协同促进肿瘤侵袭。

研究的局限性包括临床样本量较小和放疗/化疗患者的混杂因素。未来需扩大样本验证基因临床意义，并深入探索MIF通路靶向干预策略（如使用4-iodo-6-phenylpyrimidine抑制剂）在逆转耐药和抑制转移中的应用前景。