玉米对斑痣病（Tar spot）的易感性影响叶际相关细菌和真菌微生物组的组成

本研究通过Illumina MiSeq测序技术，系统分析了16个玉米自交系在自然感染条件下叶际细菌和真菌微生物组的差异。研究发现，抗病品系具有更高的真菌多样性（丰富度、均匀度和系统发育多样性），且其微生物群落结构与感病品系存在显著差异。抗病品系富集了多种有益微生物（如Quadrisphaera、Klenkia、Nocardioides等细菌属和Cladosporium、Coniothyrium、Alternaria等真菌属），而感病品系则与Erwiniaceae、Pseudomonas等病原相关微生物的富集相关。相关性分析显示，Phyllachora maydis的读长与多数微生物丰度呈负相关，表明病原侵染导致微生物生态位分化加剧。该研究为理解叶际微生物组在玉米抗病性中的作用提供了新见解，并为开发基于微生物组的病害防控策略奠定了理论基础。

　　

1 引言

玉米（Zea mays subsp. mays）是全球最重要的粮食作物之一，其生产面临多种叶部病害的威胁。其中，由专性寄生真菌Phyllachora maydis引起的斑痣病（Tar spot）近年来已成为美国玉米生产的主要经济问题，在适宜条件下可导致感病杂交种减产25–50%。该病原菌在玉米叶片和茎部形成黑色、有光泽、隆起的圆形或椭圆形子座，有时还会产生具褐色坏死晕圈的“鱼眼”症状。

目前可能的治理策略包括寄主抗性、生物防治和杀菌剂应用。其中寄主抗性被认为是最有效、经济且环境友好的策略，但在商业品种中尚未广泛应用。叶际包含丰富的附生和内生微生物，这些微生物与植物组织之间存在共生、寄生或互惠关系，并能显著影响寄主健康和生态系统功能。

先前研究表明，病害抗性与叶际微生物组在多物种中存在关联，但关于真菌性叶部病害如何影响微生物群体的动态变化知之甚少。特别是Phyllachora maydis由于几乎 exclusively 生活在叶片表面，与其他细胞内病原体相比可能更易受叶际微生物组的影响。因此，本研究旨在检验以下假设：在感染P. maydis后，抗病和感病玉米自交系的微生物群落结构存在显著差异。

2 材料与方法

2.1 玉米品系与生长条件

研究选取了16个在斑痣病严重度上存在差异的玉米自交系，包括5个来自巢式关联作图（NAM）群体的亲本系和11个来自玉米种质资源增强（GEM）项目的品系。试验位于印第安纳州Wanatah的Pinney Purdue农业中心，该地点因往年具有高斑痣病压力而被选中。由于P. maydis的专性寄生特性无法进行人工接种，所有研究均依赖自然感染。

试验采用随机完全区组设计（RCBD），设3次重复。在斑痣病症状出现后，于乳熟末期（R5）生长阶段按照0-100%疾病严重度标准进行评分。评分从冠层的三个部位（耳叶下方两叶、耳叶和耳叶上方两叶）进行，以获取全株病害严重度。

2.2 样品收集与处理

在种植后14周（R5阶段）采集样品。每个重复采集5片耳叶，用70%乙醇喷洒擦拭并干燥后，使用无菌打孔器（18mm）从每片叶避开中脉和干燥组织取6个叶盘，每个重复共30个叶盘。样品立即保存于-80°C直至DNA提取。

2.3 DNA提取与测序

使用Synergy 2.0植物DNA提取试剂盒提取DNA，并通过Illumina MiSeq平台进行测序。对细菌16S rDNA的V3-V5高变区和真菌ITS区域进行扩增，使用特异性引物进行文库构建。测序在GENEWIZ公司完成，采用2×300/250 paired-end配置。

2.4 数据分析

使用QIIME2 v.2024.2进行数据分析。细菌分类使用SILVA v138.1数据库，真菌分类使用UNITE ITS数据库（2023年7月18日发布版）并补充了Cladosporium、Epicoccum nigrum和Alternaria的序列。采用DADA2进行去噪、去重复和去除嵌合体，序列聚类为amplicon sequence variants (ASVs)。

Alpha多样性采用Faith's PD、Shannon和Pielou均匀度指数评估，beta多样性采用Bray-Curtis相异性和Unweighted UniFrac距离度量。使用PERMANOVA进行组间差异统计检验。差异丰度分析使用ANCOM-BC算法，显著性阈值设定为Benjamini-Hochberg校正后p值<0.05。使用Spearman相关系数分析P. maydis读长与最丰富类群之间的相关性。

3 结果

3.1 玉米品系的斑痣病严重度与病原检测

病害评分显示，品系PI685918和TX303为感病；PI685920、4401350、B97、PI685836和PI685915为中感；B97、PI685790和PI685831为中抗；PI685788、PI685950、PI685919、PI685806、CML103、CML69和CML52为抗病。为简化分析，将中感和感病合并为"感病"组，中抗和抗病合并为"抗病"组。

然而，MiSeq测序显示视觉评分与P. maydis读长数存在差异。一些视觉评分为抗病的品系（PI685950、PI685919、PI685788、PI685790和B97）含有超过30%的P. maydis读长。因此，结合视觉和分子数据进行重新分类，最终确定只有PI685806、PI685831、CML103、CML52和CML69为抗病品系，其余11个为感病品系。

由于读长数低于阈值，PI685950和TX303被排除在细菌微生物组分析外，CML52和TX303被排除在真菌微生物组分析外。

3.2 细菌和真菌群落的Alpha和Beta多样性

细菌Alpha多样性分析显示，抗病和感病品系间在物种丰富度和均匀度方面无显著差异，但感病品系B97和PI685788的Shannon多样性显著较低。Faith系统发育多样性在感病品系中倾向于较低，但差异无统计学意义。

与之相反，真菌群落表现出显著差异：抗病品系CML103、CML69、PI685806和PI685831的真菌丰富度、均匀度和系统发育多样性均显著高于10个感病品系。

Beta多样性分析显示，细菌和真菌群落在抗病和感病品系间均存在显著结构差异。Bray-Curtis PCoA显示抗病品系主要聚集在右下象限，感病品系分布更广泛且主要位于图上部，表明两组间群落组成存在差异。Unweighted UniFrac分析显示了类似但较不明显的聚类模式，表明群落成员组成的差异不如相对丰度差异明显。

真菌群落的变化更为显著，所有4个抗病品系聚集在一起，10个感病品系形成另一聚类，与抗病品系明显分离。Bray-Curtis相异性解释了较高比例的变异，表明相对丰度差异是驱动分离的主要因素。

3.3 抗病和感病品系中细菌和真菌群落的结构与多样性

taxonomic profiling显示，所有品系中优势细菌科为Beijerinckiaceae，此外还有Erwiniaceae、Sphingomonadaceae、Kineosporiaceae等。感病品系中Erwiniaceae、Spirosomaceae、Rhizobiaceae、Pseudomonaceae和Deinococcaceae的相对丰度较高，而抗病品系中Sphingomonadaceae、Kineosporiaceae和Nocardioidaceae更为普遍。

在属水平上，优势细菌属为Methylobacterium、Erwiniaceae gen.和Sphingomonas。感病品系中Methylobacterium、Erwiniaceae gen.、Pseudomonas和Deinococcus丰度较高，而抗病品系中Sphingomonas、Quadrisphaera、Klenkia、Nocardioides、Aureimonas、Microbacterium、Roseomonas和Pseudokineococcus更为丰富。在门水平上，所有品系中优势细菌门为Proteobacteria、Actinobacteriota和Bacteroidota。

真菌群落中，优势科为Phyllachoraceae、Cladosporiaceae、Pleosporaceae和Didymellaceae。抗病品系中Cladosporiaceae、Pleosporaceae、Didymellaceae、Phaeosphaeriaceae、Coniothyriaceae等更为丰富，而感病品系中Phyllachoraceae、Didymosphaeriaceae、Massarinceae和Leptosphaeriaceae更为普遍。

在属水平上，抗病品系中Cladosporium、Coniothyrium、Alternaria、Epicoccum、Bipolaris、Pleosporales属、Phyllozyma、Papiliotrema、Cercospora、Stagonospora和Symmetrospora明显更为丰富，而感病品系中Phyllachora、Paraphaeosphaeria和Sphaerellopsis显示较高相对丰度。值得注意的是，Phyllachoraceae科和Phyllachora属在所有品系中均被检测到。

3.4 抗病和感病品系间的差异类群丰度

差异丰度分析显示，Erwiniaceae科和Enterobacterales目（特别是Amnibacterium属）在感病品系中显著富集。相反，Microbacteriaceae科的多个属（包括Klenkia、Aureimonas、Roseomonas、Sphingomonas、Microbacterium、Nocardioides和Pseudokineococcus）在抗病品系中最为丰富。

真菌群落分析发现，多个子囊菌门物种（如Neosetophoma、Sarocladium strictum、Phaeosphaeria microscopica、Alternaria oregonensis等）在抗病品系中显著富集。而Ganoderma applanatum、Lophiostoma japonicum和Bannoa tropicalis等物种在感病品系中更为丰富。

3.5 斑痣病严重度改变叶际微生物组

相关性分析显示，P. maydis读长与细菌和真菌群落中最丰富类群间主要呈负相关关系。在20个最丰富细菌类群中，只有4个物种（Pantoea ananatis、Pseudomonas syringae、Deinococcus citri和Nakamurella deserti）与P. maydis读长呈正相关，而16个细菌类群呈显著负相关。Pseudokineococcus sp.显示最强的负相关性。

真菌物种中，只有Paraphaeosphaeria neglecta和Sphaerellopsis filum与P. maydis读长呈正相关，而Papiliotrema flavescens显示最强的负相关性。其他多个真菌类群（如Alternaria alternata、Cladosporium sp.、Coniothyrium sp.、Epicoccum nigrum等）也与P. maydis读长呈显著负相关。

这些发现表明，随着P. maydis读长增加，微生物群落内竞争加剧，导致生态位分化增加。测序数据还表明某些品系对其他常见真菌病原体易感，如PI685831、PI685915和PI685806对北方玉米叶斑病（Bipolaris zeicola）易感，PI685920对灰斑病（Cercospora zeae-maydis）易感。

4 讨论

本研究通过rRNA扩增子测序研究了16个斑痣病严重度不同的玉米自交系的叶际细菌和真菌种群，发现真菌类和种群对P. maydis序列数增加的反应比细菌更为明显。

4.1 P. maydis感染对微生物Alpha多样性的影响

细菌和真菌微生物组的Alpha多样性指数在抗病和大多数感病玉米自交系间存在差异。细菌群落方面，抗病和大多数感病品系间物种丰富度和均匀度无显著变异，表明这些品系间具有相似的物种丰富度和物种分布。但感病品系B97和PI685788的Shannon多样性显著较低，表明这些品系中存在较少样化的群落，要么物种较少，要么物种丰度不均匀。

相比之下，真菌Alpha多样性指标显示抗病和感病品系间存在显著差异，抗病品系比感病自交系具有更高的物种丰富度，表明斑痣病严重度（过度的病原负荷）对细菌和真菌群落丰富度有负面影响。

4.2 抗病和感病玉米中不同的微生物群落结构

Bray-Curtis和Unweighted UniFrac分析均证明抗病和感病玉米自交系中细菌和真菌群落存在不同的聚类模式。真菌群落与疾病抗性密切相关，特别是在相对丰度方面，如Bray-Curtis排序中的清晰分离和高解释变异百分比所证明。相比之下，细菌群落显示出弱得多的关联，抗病和感病品系在两种排序中均有大量重叠。

4.3 与抗性和感病性相关的关键细菌类群

抗病和感病品系中最丰富的细菌和真菌类群分为三个可能类别：有益、致病或共生的。抗病品系中富集了Sphingomonas、Quadrisphaera、Klenkia、Nocardioides、Aureimonas、Microbacterium、Roseomonas和Pseudokineococcus等属。这些有益属促进应激耐受性并可能改善整体植物生长。

相反，感病品系中Methylobacterium、Erwiniaceae未知属、Pseudomonas、Deinococcus和Amnibacterium升高。Erwiniaceae和Pseudomonas包括机会性病原体，据报道可引起玉米病害。

4.4 与抗性和感病性相关的关键真菌类群

真菌微生物群落以Phyllachoraceae、Cladosporiaceae、Pleosporaceae和Didymellaceae科以及Phyllachora、Cladosporium、Coniothyrium和Alternaria属为主。Phyllachora读长在所有自交系中均被检测到，甚至那些被评为最抗病的品系中也存在，且疾病严重度通常随着Phyllachora序列占真菌读长百分比的增加而增加。

抗病品系中最丰富的真菌属为Cladosporium、Coniothyrium、Alternaria、Papiliotrema、Epicoccum、Bipolaris、Pleosporales属、Didymellaceae属、Cercospora、Stagonospora和Symmetrospora。这些属的成员已被证明对各种植物病虫害具有生物防治特性。

另一方面，除Phyllachora本身外，Paraphaeosphaeria、Sphaerellopsis、Polyporales sp.、Bannoa tropicalis、Lophiostoma japonicum、Ganoderma applanatum和Didymella在感病自交系中相对增加，表明这些类群可能有助于斑痣病感病性或疾病进展。

4.5 驱动微生物组变化的复杂相互作用和潜在机制

潜在有益细菌和真菌类群在感病品系中随着P. maydis负荷增加而减少，表明斑痣病严重度影响细菌和真菌群落。随着疾病进展，P. maydis可能排挤或抑制这些有益微生物类群为自己谋利，进一步加剧疾病。

至少有六种特定关系可在这些限制内运作：物理排挤、资源竞争、抗生素生产、宿主防御反应触发、受体变异和化学拮抗作用。

4.6 更广泛的影响和未来方向

据我们所知，这是首个在自然感染P. maydis条件下研究抗病和感病玉米品系叶际细菌和真菌微生物组的分析。研究发现P. maydis感染导致不同的微生物群落，抗病和感病品系间差异丰富的类群可能对控制玉米斑痣病具有潜力。

相关性分析揭示了P. maydis与玉米微生物组间的复杂关系，负相关为主表明微生物群落内存在潜在竞争和生态位分化。与Phyllachora读长强正相关的生物可能是可能的真菌寄生菌，随着食物供应增加而增加丰度。相反，与Phyllachora读长高度负相关的生物可能是直接竞争或产生抑制斑痣病发展的化合物的拮抗剂。

与斑痣病相关的微生物组有潜力影响宿主防御，并可用于未来基于微生物组的治理策略。然而，我们对微生物功能性的理解仍存在重大差距，这对于确定微生物如何影响宿主健康至关重要。这一差距可通过宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学等先进方法来弥补，以获得对微生物功能更深入的见解并将其与宿主表型联系起来。

最近，微生物组工程已成为直接操纵功能重要微生物以改善整体植物适应性和生产力的有前景策略。然而，有效的微生物组工程需要对玉米微生物组有系统水平理解，包括微生物-微生物相互作用网络和宿主-微生物相互作用。这将使我们能够成功操纵有益微生物（合成群落）来提高植物抗性、适应性和整体生产力。