αTAT1调控剂的计算机与实验鉴定：对神经系统功能的影响与药物发现新策略

本研究通过结合计算机辅助药物设计（CADD）和实验验证，成功鉴定出新型αTAT1（α-微管蛋白乙酰转移酶1）调控剂，揭示了其在神经干细胞（NSCs）增殖与分化中的关键作用，为疼痛相关神经系统疾病的靶向治疗提供了新思路。

　　

引言

微管（MTs）作为真核细胞骨架的核心组成部分，由α和β微管蛋白异源二聚体聚合而成。多样的微管蛋白亚型和丰富的翻译后修饰（PTMs）精确调控微管的特性和功能，构成所谓的“微管密码”。在这些PTMs中，乙酰化是一种关键修饰，尤其由αTAT1（α-微管蛋白N-乙酰转移酶1）催化，在Lys40位点特异性乙酰化α-微管蛋白。这一过程与微管动力学调节、稳定微管的机械应力保护密切相关，并参与DNA复制、细胞迁移和轴突运输等核过程。鉴于αTAT1在细胞骨架稳态中的核心作用及已知效应剂的缺乏，本研究聚焦于该酶，旨在探索其调控剂及其对神经系统功能的潜在影响。

方法与材料

分子对接与药效团搜索

研究从UniProtKB数据库获取人源αTAT1序列（Q5SQI0），并利用内部服务分析其在蛋白质数据库（PDB）中的类似物或复合物结构。最终选用与乙酰辅酶A及双底物类似物结合的晶体结构（PDB ID: 4G4和4PK3）作为结合模式评估的起点。通过PyMOL插件、CavitOmiX、PLIP等结构方法以及基于配体的位点映射方法（LigPlot与LigandScout 4.4），详细描述了4PK3中扩展的结合口袋。研究映射了结合腔内所有潜在的配体-蛋白质相互作用，包括供体和受体，以确定其反应性并识别关键残基和原子。

基于CavitOmiX内探针的坐标，确定了后续描述符的 centroid，并根据相应相互作用类型的典型距离进行选择。最终结构（蛋白质片段+剩余探针）保存为.pdb格式，并在LigandScout程序中完成模型的最终优化。生成的药效团模型以.pmz格式保存，与Pharmit在线服务兼容，并连接到Enamine化合物库进行筛选。系统设置中，特征属性包括直径设定（R=1）、根据靶点位点的供体/受体及芳香氨基酸环片段的centroid调整相互作用向量，允许平行/垂直堆积（π-π）。最终，结合位点的配体对接模型基于三个疏水区域锚点、四个氢键原子和一个空间约束（对应带负电的基团）构建。筛选结果根据“Score”排序，阈值定义为对照组化合物中的最小Score值。

对照组化合物还通过CCDC Gold 5.3程序进行分子对接处理，该程序基于遗传算法生成新配体构象。通过Hermes添加氢原子，使用实验解决的质子化配体构象定义相互作用和结合区域。对接结合区域半径（5?）以晶体结构（4PK3）中底物的磷酸基团为中心定义。初始设定包括与Ile126、Gly134、Gly136骨架原子的氢键约束，但最终关注与Arg132和His170的相互作用，并设为氢键约束。将Gln131设为柔性残差以增加与新型配体的有利相互作用。疏水区域约束设定在Phe124和Phe166之间。对接过程使用标准参数，包括种群大小100、样本大小1.1、10个岛屿和100,000次遗传操作。对接图在矩形框中创建，网格间距0.5?，以预测配体结合位点为中心。适应性函数设置包括ChemPLP作为初筛，随后通过ASP函数（Astex统计势）重新评分。最终筛选结果通过DataWarrior分析预测ADME参数。所有计算程序均在CSLabGrid虚拟实验室中完成。

神经干细胞的分离与活力测定

动物使用遵循Bogomoletz生理研究所（乌克兰基辅）动物护理与使用委员会及乌克兰实验动物保护法（N3447-IV, 21.02.2006）批准的协议。分离方法如前所述。简要来说，从16–17 dpc FVB-wt小鼠胚胎（n=12）的海马神经干细胞（NSCs）在无菌条件下于Neurobasal培养基（Gibco, 美国）中机械解离。分离的细胞悬液通过40μm尼龙细胞筛网（Falcon, 美国）过滤。NSPC部分通过22% Percoll密度梯度在450g离心10分钟（GE Healthcare BioScience, 瑞典）纯化。细胞活力通过流式细胞术基于7-氨基放线菌素D（7-AAD）掺入测定，并使用BD FACSAria细胞分选仪（Becton Dickinson, 美国）和BD FACSDiva软件版本6.2.1（Becton Dickinson, 美国）分析。

在不同化合物（C1、C2、C3、C4和C5）补充培养基中培养神经干细胞

NSCs以5×10⁴细胞/孔的密度接种在Matrigel包被的盖玻片（BD Biosciences, 英国）上，在24孔板中于标准培养条件（5% CO₂, 37°C）下培养48小时。标准培养基为Neurobasal培养基（Gibco, 美国），补充20 ng/mL bFGF（Sigma, 美国）、2% B27补充剂（Invitrogen, 美国）、1 mM丙酮酸钠（Invitrogen, 美国）、1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（Sigma, 美国）、1% L-谷氨酰胺（HyClone, 美国）和1%青霉素-链霉素（Invitrogen, 美国）。

48小时后，NSCs分为22个实验组并再培养48小时：（a）标准培养基；（b）标准培养基+10 μM C1；（c）标准培养基+100 μM C1；（d）标准培养基+10 μM C2；（e）标准培养基+100 μM C2；（f）标准培养基+10 μM C3；（g）标准培养基+100 μM C3；（h）标准培养基+10 μM C4；（i）标准培养基+100 μM C4；（j）标准培养基+10 μM C5；（k）标准培养基+100 μM C5；（l） deprived of bFGF的标准培养基；（m） deprived of bFGF的标准培养基+10 μM C1；（n） deprived of bFGF的标准培养基+100 μM C1；（o） deprived of bFGF的标准培养基+10 μM C2；（p） deprived of bFGF的标准培养基+100 μM C2；（q） deprived of bFGF的标准培养基+10 μM C3；（r） deprived of bFGF的标准培养基+100 μM C3；（s） deprived of bFGF的标准培养基+10 μM C4；（t） deprived of bFGF的标准培养基+100 μM C4；（u） deprived of bFGF的标准培养基+10 μM C5；（v） deprived of bFGF的标准培养基+100 μM C5。

接种后总培养时间为4天。使用倒置显微镜（Olympus IX 71, 日本）观察不同条件下NSCs的生长和初级粘附球（神经球）的形成。

培养NSCs的免疫细胞化学分析

NSC培养物用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用洗涤缓冲液（0.1 M PBS）洗涤。封闭使用封闭溶液进行至少2小时，用于透化（洗涤缓冲液补充0.3% Triton X-100和0.5% BSA）。NSCs在4°C下于封闭溶液中与制造商推荐浓度的一抗孵育过夜。为鉴定NSCs、增殖细胞和分化为神经元的NSCs，使用针对Nestin（1:100, Santa Cruz Biotechnology, 美国）、Ki-67（1:200, Abcam, 英国）、α-tubulin（1:200, Abcam, 英国）、β(III)-tubulin（1:700, Sigma, 德国）和MAP-2（1:2000, Abcam, 英国）的抗体进行双重免疫染色。Nestin表达作为神经干细胞和前体细胞的标志物；β-tubulin (III)是神经元谱系的特异性标志物。

之后，细胞用洗涤缓冲液洗涤3次，每次15分钟，然后在室温下与二抗孵育至少2小时。二抗为：抗鸡Alexa Fluor 488（1:1000, Invitrogen, 美国）、抗小鼠Alexa Fluor 555（1:1000, Invitrogen, 美国）和抗兔Alexa Fluor 647（1:1000, Invitrogen, 美国）。图像使用激光扫描共聚焦显微镜FluoView^TMFV1000（Olympus, 日本）拍摄。

统计分析

使用统计软件（version 5, StatSoft, Tulsa）进行统计分析。结果以均值±标准误（SEM）表示。化学物质对细胞的影响通过单因素方差分析（ANOVA）与Tukey事后HSD检验确定。Kruskal-Wallis检验用于比较不同培养条件下形成的初级神经球数量。P < 0.05时认为均值差异显著。

结果

计算机搜索潜在αTAT效应剂

对αTAT1结构（4PK3, 1.35 ?）的初步分析表明，其活性位点具有扩展、庞大的结合口袋。该口袋显示出最小的配体-蛋白质适应特征，可能由于其大小和底物性质所致。此外，结构精度分析的全局QMEANDisCo指数为0.83 ± 0.05，而Ramachandran图分析显示94.82%的氨基酸残基位于允许区域。

研究通过测试口袋的氨基酸组成和表面特征开始。相应的未来描述符centroid在填充靶点位点口袋的CavitOmiX内探针中确定，并根据相应相互作用类型的典型距离进行选择。单独发现，考虑到4?的距离，6个芳香氨基酸可能参与配体结合，即：Phe124、Tyr125、Phe166、His135、Phe166和His170。

进一步的拓扑结构和构象流动性分析确定只有Phe124和Phe166可能与配体形成潜在的π-π相互作用。因此，构建了未来药效团的最终骨架，包含相互作用的组合以供未来搜索。最终模型由九个描述符组成：6个氢键受体、1个氢键供体和2个环片段标记。

同时，对Hsu等人（2021）鉴定的10种候选αTAT1抑制剂进行了对接研究。根据CCDC GOLD FitnessScore，其中7种化合物对靶点位点的预测结合亲和力强于天然底物（4PK3中的乙酰-CoA），但它们的结合方向没有共同趋势。同时，两种化合物（Ceftolozane和Oftasceine）被指定为非认知配体，显示缺乏足够的相互作用。另一种化合物Mangafodipir由于其复杂的金属螯合结构难以对接并最终解释其姿势。

通过分析不同残基与底物（αTAT1晶体复合物）或这10种化合物的相互作用速率，确定了感兴趣位点中重叠的功能基团。结合之前基于结合位点解构的建议，在基于结构的协议中选择了所有相关特征，以生成针对新型配体（非认知底物）潜在相互作用的靶向预测。将这些总接触池分为三组相互作用，与Hsu等人（2021）声明的不同。第一组包括氨基酸残基His133、Arg137、Gly134、Gly136、Ser160、Phe124和Ile126，与配体的酮基、磷酸基、磺酸基和氨基形成氢键。第二组残基Lys162、Asp123和Tyr125，可通过涉及噻唑杂环和酮基的弱氢键与配体相互作用。作为替代相互作用模式，第三组Arg132和Lys169可与配体的杂环和磷酸基形成带电接触。使用PharmIT网络服务，对公共在线配体库：ChEMBL DB、ZINC DB和PubChem进行了扫描。使用完整药效团，在ChEMBL数据库中找到10个命中，在ZINC数据库中找到78个命中。

在CCDC GOLD程序中使用ChemPLP和ASP适应性函数组合进行分子重新对接，仅确定7个领先化合物适合靶点位点而无冲突且具有显著的亲和力和复合物质量指标。值得注意的是，所选配体的相互作用指数高于对照组最佳化合物Pralatrexate。这7种化合物通过DataWarrior分析预测ADME参数并显示类药性属性分布（MW – 分子量、HBA/HBD – 受体/供体、cLogP/cLogS – 溶解度、PSA – 极性表面积）。试图在类药性值、分子量和对接分数之间取得平衡，仅选择了五种准备在细胞中评估的化合物。

实验确认aTAT1靶向

根据NSCs活力测试结果，发现悬液中活细胞百分比不低于94.8% ± 0.3%，这是新鲜分离NSCs高活力的指标。在标准条件下（添加bFGF）培养NSCs时，细胞数量为1109.96 ± 44.82（n=47）每平方毫米，而当在培养基中添加10 μM C1、C2、C3、C4和C5（分别为Z1865409129、Z114028832、Z165539016、Z183856850和Z15983322）时，NSCs数量显著减少至782.85 ± 59.77（n=16）（p < 0.001）、609.12 ± 48.01（n=17）（p < 0.001）、852.72 ± 62.01（n=17）（p < 0.01）和300.86 ± 78.28（n=15）（p < 0.001）每平方毫米，而添加相同浓度的C4并未导致细胞数量发生显著可靠变化 - 943.01 ± 72.14（n=18）。同时，将C1-C5浓度增加至100 μM导致NSCs数量发生显著变化，即减少：690.56 ± 40.92（n=16）（p < 0.001）、919.92 ± 76.04（n=17）（p < 0.05）、801.08 ± 65.51（n=17）（p < 0.001）、937.21 ± 61.03（n=18）（p < 0.05）和272.83 ± 39.17（n=15）（p < 0.001）每平方毫米。应注意，在无bFGF的情况下，虽然10 μM C1显著降低NSCs数量（如前所示），但将C1浓度增加至100 μM导致细胞数量显著增加（p < 0.05）。类似地，在无bFGF的情况下，C4和C5显著减少NSCs数量（分别为p < 0.01和p < 0.05）。值得注意的是，C5在所有测试条件下（48小时）持续导致NSCs数量显著减少，在某些孔中仅观察到单个细胞。这些发现共同表明C5对NSCs具有细胞毒性作用。

培养条件影响初级粘附神经球的形成。具体而言，在添加bFGF的对照培养物中，观察到形成18.48 ± 1.26个直径小于50微米的神经球和0.31 ± 0.12个直径大于50微米的神经球每平方毫米（n=47）。当在培养基中添加10 μM和100 μM C1-C4时，直径<50微米的神经球数量显著增加。然而，添加浓度为10 μM和100 μM的C5显著减少神经球形成。类似地，不同浓度的C3也显著影响神经球形成；具体而言，增加C3浓度导致直径<50微米的神经球数量 substantially greater。

在添加bFGF的实验培养物中添加化合物C1、C2、C3和C4导致直径大于50微米的神经球增加。在培养基中添加C5，在所有测试浓度下均未形成直径超过50微米的神经球。

在无添加bFGF的情况下培养NSCs导致形成各种直径的初级粘附神经球。添加10 μM C1显著减少直径<50微米的神经球数量，而添加100 μM C1显著增加神经球数量。另一方面，在培养基中添加10 μM和100 μM C2导致直径<50微米的神经球数量增加。C3-C5在10 μM和100 μM浓度下导致直径<50微米的神经球数量减少。虽然当在培养基中添加100 μM C3时，观察到给定直径神经球数量显著增加，但与10 μM C3培养相比，该指标仍低于对照。增加C5浓度导致直径<50微米神经球数量显著减少。

在NSC培养基中添加C1-C5也影响直径大于50微米神经球的形成。具体而言，C1-C3在10 μM和100 μM浓度下增加这些较大神经球的数量。值得注意的是，不同C1浓度在神经球（>50微米）数量上观察到显著差异；较高C1浓度导致这些较大神经球数量显著 greater。在培养基中添加10 μM C4略微增加神经球>50微米的数量。相比之下，100 μM C4导致减少。无论是否存在bFGF，C5在所有测试浓度下均抑制直径超过50微米神经球的形成。

本研究还对不同条件下培养的NSCs进行了免疫细胞化学评估。在标准条件下（含bFGF）生长的NSCs保持其未分化状态（由Nestin指示），并显示出显著的增殖潜力（由Ki-67指示）。在这些标准培养物（含bFGF）中，还观察到少量MAP-2阳性神经元和α-及β(III)-tubulin阳性神经母细胞骨架元件，表明单个细胞或神经球内开始分化。相比之下，在无bFGF条件下培养NSCs导致Ki-67阳性细胞显著减少（增殖减少）和向神经元分化的 substantially increase。

在添加10 μM和100 μM C1–C4后，观察到总细胞数减少和NSC增殖显著减少，同时表达神经元标志物MAP-2、α-tubulin和β(III)-tubulin的细胞增加。神经球内也出现显著的神经元分化。有趣的是，当在含bFGF条件下用C2（不同浓度）培养NSCs时，根据Ki-67标志物观察到增殖活性降低，同时神经球数量显著增加，这些神经球主要包含分化的细胞 - 神经元。值得注意的是，在无bFGF培养基中，10 μM C4与对照相比显著增加增殖NSCs的数量。这表明该特定浓度的C4可以独立于外源bFGF支持NSC增殖。相反，C4的存在与对照培养相比显著抑制神经元分化和神经球形成。

总之，短期（48小时）与C1–C4培养允许NSCs保持活力和其他干细胞特性。这些化合物还影响NSC增殖和初级粘附神经球的形成。此外，C1、C2、C3和C4的存在导致细胞骨架微管蛋白α-tubulin和β(III)-tubulin组分出现明显的质和量变化。因此，得出结论：C1–C4直接影响NSC增殖和向神经元分化，且在测试浓度下不表现出细胞毒性。相比之下，C5在所用浓度下对NSC培养物具有毒性。

结论

尽管结合位点几何结构复杂，但通过结合结构和配体方法的复杂组合，开发了有效的高通量筛选模型。实时参数调整证明是有益的，允许快速准确分析大型数据库，并确保程序可重复性，适应每次迭代的变化。因此，尽管缺乏特异性参考抑制剂，分子筛选鉴定出一组具有潜在活性的化合物。对αTAT1与实验验证配体复合物的结构分析允许提出三种特异性抑制的药效团假设，并开发出最功能的αTAT1对接模型。重要的是，神经干细胞与新型分子（C1、C2、C3、C4）的短期培养表明，NSCs保持了其活力和其他特征性干细胞特性。观察到添加到培养基中的C1、C2、C3和C4影响NSC增殖和初级粘附神经球的形成。此外，这些化合物诱导细胞骨架微管蛋白α-tubulin和β(III)-tubulin的质和量变化。因此，研究结果表明新分子（C1–C4）直接影响NSC增殖和分化（尤其是向神经元），并且在所用浓度下无细胞毒性。获得的数据将用于 refine 药效团模型以提高准确性，并促进进一步筛选Enamine和Life Chemicals商业数据库。

本研究有助于一个旨在识别伤害性神经系统间接调控剂的项目。尽管疼痛相关离子通道的研究方法单独开发，但增强的αTAT1抑制活性表明未来有一个汇聚点，用于间接阻断疼痛级联反应。