长期变暖加剧波罗的海沿岸季节性海底甲烷释放风险：微生物群落响应与气候反馈机制研究

本文揭示了长期变暖通过改变沉积物微生物群落结构（如ANME-1古菌和SRB细菌）和地球化学过程（如硫酸盐-甲烷转换区SMTZ变浅），显著提升波罗的海近海底甲烷浓度（达50倍），加剧温室气体（CH4）向大气释放的气候风险。

　　

1 引言

气候变暖已成为全球性环境问题，对海洋系统产生连锁影响，包括海水升温、脱氧、酸化和海平面上升。尽管沿海区域仅占海洋总面积的约3%，却贡献了近一半的全球海洋初级生产力，并提供碳封存、渔业生产和生物多样性栖息地等重要生态服务。波罗的海作为一个半咸水内陆水体，与开放海域连通有限，其表层温度在1990-2008年间以每十年0.6°C的速度上升，预计到21世纪末将升高1.9-3.2°C。同时，由于富营养化和温度上升，溶解氧水平下降，缺氧/无氧区域（“死区”）在过去一个世纪扩大了十倍。

甲烷(CH₄)是仅次于二氧化碳(CO₂)的重要温室气体，其增温潜能是CO₂的20倍以上。海洋沉积物中的甲烷是大气甲烷预算的重要来源，其中浅海沿岸区域贡献了大部分排放。沿海环境中的甲烷生成过程包括沉积物中的微生物产甲烷作用，甲烷可通过气泡或海底扩散进入水体和大气。气候变暖相关的海洋生产力提高预计会加剧死区的形成，并使地球化学区变浅，导致甲烷生成更接近沉积物表层。尽管已知夏季热浪后甲烷排放较高，但全年甲烷通量在长期变暖下的变化尚不明确。

甲烷通过微生物氧化被消耗，这一过程称为“甲烷营养”。在缺氧沉积环境中，甲烷厌氧氧化(AOM)将甲烷氧化与硫酸盐还原等过程耦合，消耗了全球大部分海底沉积甲烷（水深<200米处每年45-61 Tg CH₄）。AOM发生在沉积物硫酸盐-甲烷转换区(SMTZ)，这是上覆微生物硫酸盐还原层与下伏甲烷生产层之间的过渡带。AOM通常由厌氧甲烷氧化古菌(ANME)和硫酸盐还原细菌(SRB)通过共生过程完成，电子直接从ANME传递给SRB。波罗的海河口沉积物中的甲烷和硫酸盐通量存在季节性变化，夏季较高，冬季较低，受有机质沉积和温度等因素控制。然而，未来气候变暖下SMTZ中的产甲烷/硫酸盐还原及相关微生物群落如何变化仍知之甚少。

本研究在一个受附近发电厂冷却系统排放温水影响已50年的波罗的海海湾进行，该海湾年平均水温比对照海湾高5.1°C。除水温和相关生物地球化学参数外，两海湾特征基本相似，是研究长期变暖对自然季节性波动影响的理想系统。先前研究发现，长期变暖改变了沉积物微生物群落的多样性和垂直结构，并增加了硫酸盐向沉积物的向下通量。硫酸盐通量的线性剖面表明AOM主导的硫酸盐还原，因此也可作为等效向上甲烷通量的代理指标。此外，加热海湾沉积物中浅层产甲烷菌多样性和相对丰度的增加证实了硫酸盐通量增加和SMTZ变浅。这可能导致微生物群落在更浅深度产生更高甲烷浓度，增加海底甲烷释放潜力。巴西的其他研究也发现了类似模式，甲烷在浅层沉积物中积累，沉积物微生物群落多样性受沉积深度、甲烷浓度和有机质浓度影响。然而，SMTZ如何迁移及其对甲烷向水柱通量的相互影响尚未明确。

本研究旨在探究沉积物甲烷和硫酸盐浓度及通量，以及相关微生物群落在夏季和冬季对长期变暖的响应，该自然系统的年际变化密切反映未来变暖情景。选择夏季和冬季是因为夏季代表极端高温（常超过30°C），而冬季是两海湾温差最大的季节。假设如下：(1)加热和对照海湾的沉积物甲烷和硫酸盐通量在夏冬两季存在变异；(2)两海湾间的甲烷和硫酸盐通量差异在夏季较冬季小，因为夏季温差较小；(3)微生物群落因夏冬两季海湾间甲烷和硫酸盐通量变异而不同。

2 材料与方法

2.1 采样点与沉积物切片

采样点地图见图1，GPS坐标、水深和地球化学数据见补充表S1。在两海湾水面下1米处安装温度记录仪(HOBOware)进行全年连续水温监测。长期温度监测数据先前已发表，包括本研究的数据见补充图S1。由于采样点水深较浅，底层水温与表层测量值的差异可能较小，季节性趋势一致。使用HTH重力取芯器从两海湾采集沉积物岩心，2021年8月作为夏季样本（每海湾n=3），2022年3月作为冬季样本（每海湾n=3）。采样细节见先前研究。

所有沉积物样本在现场立即按特定深度切片用于不同目的（沉积物采样方案见补充图S2）。用于气体测量的沉积物岩心在四个深度区间（2-6 cm、9-13 cm、16-20 cm和23-27 cm）切片，每个深度区间收集133 mL沉积物放入600 mL气密罐(Isojar)，加入200 mL蒸馏水和10滴苯扎氯铵以抑制微生物活性并形成200 mL顶空。孔隙水通过真空过滤每2 cm（夏季）或每4 cm（冬季）深度120 cm3沉积物获得，使用Rhizon过滤器。气体和孔隙水采样细节见已发表方法。最后，微生物核酸样本在五个深度区间（0-1 cm、1-2 cm、8-9 cm、15-16 cm和22-23 cm）收集，4°C运输至实验室，同日存入-80°C冰箱。

2.2 地球化学分析与通量

基于先前研究，使用分光光度法测量沉积物孔隙水中的硫酸盐、总铁和磷酸盐。硝酸盐浓度通过Hach-Lange比色管测试LCK339测量，如先前描述。有机质含量通过灼烧失重(LOI)法测量，样品在105°C干燥24小时，后在550°C加热4小时，重量损失代表有机质含量。沉积物甲烷浓度通过将0.5 mL Isojar样本顶空气体注入配备PoraPLOT-Q 25 m×0.32 mm毛细管柱和火焰离子化检测器的ThermoFisher Trace GC 1310气相色谱仪测量。操作温度为80°C（炉温）、170°C（进样）和250°C（检测器）。氦气作为载气，流速5 mL min?1。顶空甲烷浓度通过比较样本与五个不同甲烷浓度（10 ppm、100 ppm、1000 ppm、1%和10%）的校准标准确定。总CH?浓度（顶空和溶解于水）根据顶空平衡法计算，沉积物孔隙度假设为80%（未压实泥质沉积）。硫酸盐扩散通量使用菲克第一定律计算：J = -D(dC/dX)，其中J为扩散通量，D为扩散系数，dC为两深度间甲烷/硫酸盐浓度差，dX为两考虑点间的深度差。孔隙度影响使用对数方程计算。通量在海床和无硫酸盐深度(DNS)间计算，后者通过硫酸盐剖面的线性回归确定。岩心F（夏季）和I（夏季）的硫酸盐剖面明显非线性，被排除计算。

2.3 核酸提取、PCR扩增与测序

核酸提取、聚合酶链反应(PCR)扩增和测序程序先前已描述。简要而言，沉积物DNA提取使用DNeasy? PowerSoil Extraction Kit (QIAGEN)按制造商说明进行。16S rRNA基因片段扩增使用PCR引物341F-805R（细菌）和517F-958R（古菌）。文库制备如先前描述，后在瑞典斯德哥尔摩的Science for Life laboratory (SciLifeLab)使用Illumina MiSeq平台测序。

2.4 生物信息与统计分析

16S rRNA基因双端 reads (2×301 bp) 使用ampliseq (v. 2.7.0) 流程分析，包括一系列生物信息过程（质量控制、扩增子序列变异(ASVs)推断和分类学分配）。瑞典生物多样性数据基础设施(SBDI) Sativa策定的16S基因组分类数据库(GTDB)用作分类学分配的参考数据库。对于微生物群落差异，基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析(PCoA)通过R中“vegan”包的“vegdist”函数计算。之后，使用“vegan”包的“adonis2”函数进行置换多元方差分析(PERMANOVA)。每个分类水平的相对丰度基于所有相关ASVs的计数计算。差异丰度分析通过“ANCOMBC”包的“ancombc2”函数在科水平进行，p值使用Holm-Bonferroni方法校正多重比较。典范对应分析通过“vegan”包的“cca()”函数完成。地球化学参数的线性混合模型使用“lmerTest”包的“lmer”函数。

3 结果与讨论

对照海湾夏季（2021年6月1日至9月22日）平均水温为19.9±3.3°C（范围12.1-27.5°C），冬季（2021年12月21日至2022年3月20日）为2.7±0.9°C（范围0.01-7.1°C）。加热海湾夏季平均水温为23.9±3.4°C（范围17.3-32.2°C），冬季为9.5±2.3°C（范围3.4-14.1°C）。这些温度在加热海湾显著高于对照海湾（t检验，p<0.001；补充图S1），且自2017年12月开始测量以来两海湾间温度差异一致。这也支持本研究结果可反映多年模式，因为温度波动通常遵循相同的年度趋势。

基于线性混合效应模型对其他地球化学参数（包括硝酸盐、磷酸盐、铁和有机质；补充表S2）的结果，硝酸盐、磷酸盐和有机质值与沉积深度显著相关（ANOVA，p<0.05）。然而，那些地球化学参数在海湾因素或海湾×深度交互作用上无显著差异（补充表S2）。这表明那些地球化学参数的水平在两海湾间无统计学差异。因此，主要差异可能与甲烷和硫酸盐浓度相关，这将在后续章节讨论。

3.1 对照海湾的甲烷和硫酸盐浓度与通量

对照海湾沉积物甲烷浓度从4 cm深度的0.001 mM增加至32 cm below seafloor的0.8 mM（图2a）。数据还显示所有单个点位的夏季甲烷浓度高于冬季，尤其在20 cm以下深度（图2a）。冬夏间最高增加—约47倍—出现在点位I海床下11 cm。相比之下，近海床甲烷浓度（4 cm深度）在点位J和I分别增加了2倍和15倍（图2b）。在沿海沉积物甲烷浓度中观察到的两个极端季节（冬-夏）变异，夏季浓度较高，冬季较低，已在其他近岸区域（波罗的海、地中海和瓦登海）的不同地理、地质和气候背景下报道，归因于温度升高对产甲烷作用的直接影响。据信相同的温度升高对消耗甲烷的过程（如AOM耦合硫酸盐还原）影响较小，导致沉积物孔隙中甲烷积累和向海床的甲烷通量增加。沿海沉积物甲烷浓度的季节性增加也可能导致夏季/秋季向水柱和大气甲烷排放的增加。

对照海湾夏冬两季观察到的甲烷浓度变化也反映在硫酸盐浓度中，作为AOM与硫酸盐作用的结果（图2c）。硫酸盐浓度从海床向下降至无硫酸盐深度(DNS)；即沉积物中所有硫酸盐被消耗的深度。平均DNS在夏季（25 cm）比冬季（37 cm）更浅，表明温暖季节硫酸盐消耗更快。这一观察得到计算的夏季较高硫酸盐通量（平均1.06 mmol cm?2 d?1）相对于冬季（平均0.68 mmol cm?2 d?1）的支持。上述通量和季节差异与波罗的海另一沿海区域计算的通量相当（尽管绝对值较小），夏季和冬季分别为2.7和1.3 mmol cm?2 d?1。冬季，硫酸盐浓度从表层增至5-10 cm深度峰值，可能由于海水盐度季节性波动降低了沉积物表层硫酸盐浓度。然而，需进一步研究确认。

3.2 加热海湾的甲烷和硫酸盐浓度变化

除夏季点位F外，夏冬两季甲烷浓度均从4 cm深度的0.003 mM增加至32 cm below seafloor的0.7 mM（图2a）。夏冬间甲烷浓度总体增加的模式在加热海湾也被检测到，但程度更显著。例如，夏季近海床（即4 cm深度）甲烷浓度相对于冬季增加了高达760倍（对照海湾为15倍增加；图2b）。此外，除加热海湾点位F外，所有深度和季节的加热海湾甲烷浓度均高于对照海湾（图2a）。上述观察与温度季节性变化对沉积物甲烷浓度有主要影响一致，并首先揭示了年平均温度升高约5°C与近海床甲烷浓度增加50倍相关。这一观察特别相关，因为到本世纪末气候变暖可能引起类似幅度的温度升高。因此，可以预期在未来气候变情景下，波罗的海沿海区域将遭遇比现今近海床沉积物测量值高50倍的甲烷浓度。虽然无直接证据表明加热海湾变暖导致海底甲烷释放，但增加的甲烷浓度可能损害微生物过滤器去除甲烷的能力。此外，其他混杂因素如有机质输入和沉积物压实也可影响变暖对甲烷和硫酸盐剖面的效应。虽然结果表明变暖与甲烷浓度增加间存在相关性，但需进一步研究使用实验对照确认两者间直接联系。

出乎意料的是，数据显示加热海湾夏季（1.01 mmol cm?2 d?1）和冬季（0.93 mmol cm?2 d?1）的平均硫酸盐通量与对照海湾夏季（1.06 mmol cm?2 d?1）相比差异不大，对照海湾冬季为0.68 mmol cm?2 d?1（补充表S3）。先前研究报道春季加热海湾硫酸盐通量高于对照海湾，且加热海湾全年平均通量较高。夏季相似硫酸盐通量但加热海湾较高甲烷浓度可能表明AOM无法消耗这过量甲烷，因此可能处于阻止甲烷积累的能力边缘。然而，需进一步数据如RNA转录本测序确认这一结论。在环境对照海湾条件下，夏季增加的甲烷生产可能在晚秋和早冬被补偿或消耗，因为甲烷浓度在冬末（三月）降低。然而，加热海湾条件下甚至在冬末和可能全年发生较高硫酸盐通量。加上AOM可能处于能力边缘的观察，这进一步表明夏季产生的过量甲烷可能未在寒冷月份被完全消耗，可能导致逐步积累和海底甲烷释放。需更多研究确认这一假设，但加热海湾两个点位（C和F；图2a）海床下4 cm处发现的高甲烷浓度可能表明夏季存在从沉积物向水柱的活跃、 albeit small甲烷扩散通量。同样重要的是，不仅温度，波罗的海富营养化的进展将导致脱氧和更高颗粒有机质沉积，因此可能增加沉积物中甲烷生成。

3.3 16S rRNA基因扩增子测序

Illumina 16S rRNA基因扩增子测序共生成27,259,341 reads，平均给出1,092个扩增子序列变异(ASVs；最小13，最大4,590)。测序和read数的详细信息见补充表S4，稀疏分析给出近渐近曲线，表明样本测序深度足以识别大多数微生物群落（补充图S3）。

3.4 基于16S rRNA基因的群落差异

古菌16S rRNA基因测序ASV相异性显示冬夏两季加热和对照海湾间存在清晰差异（图3；海湾主效应：F?,??=23.78，R2=0.210，p=0.001），冬季分离距离更长（海湾×季节交互：F?,??=2.14，R2=0.019，p=0.039）。深度是分离古菌群落和修饰海湾间分化的另一重要因素（深度：F?,??=15.77，R2=0.139，p=0.001；海湾×深度交互：F?,??=4.54，R2=0.040，p=0.002）。夏冬两季间分离距离不如海湾分离清晰，但统计学显著（季节：F?,??=2.95，R2=0.026，p=0.006）。类似古菌结果，细菌群落PCoA显示不同沉积深度间和加热与对照海湾间的分离，海湾再次修饰与沉积深度的关联（图4）（海湾：F?,??=25.52，R2=0.206，p=0.001；深度：F?,??=19.34，R2=0.156，p=0.001；海湾×深度交互：F?,??=6.73，R2=0.054，p=0.001）。再次，夏冬两季间分离显著但在可视化中不如海湾间距离清晰（季节：F?,??=5.86，R2=0.047，p=0.001）。总体而言，海湾和深度是分离基于16S rRNA基因微生物群落的两个主要因素，这与先前数据一致。

3.5 基于16S rRNA基因的冬季群落

冬季相对丰度最高的两个古菌科是TCS64和UBA233（图5，进一步分类水平见补充图S4）。在对照海湾，UBA233科在深层沉积物（22 cm：13.0±1.9%）比表层样本（0 cm：33.8±10.5%）平均相对丰度较低，而TCS64科平均相对丰度在深层沉积物（22 cm：51.6±3.7%）比表层（0 cm：25.7±3.8%）增加。相反，UBA233科在加热海湾呈现相反条件，深层沉积物相对丰度增加（0 cm：21.6±1.8%；22 cm：38.0±6.0%），而TCS64科保持稳定平均相对丰度（约40%）。虽然这两个科缺乏详细功能描述，但先前在海洋深层沉积物和节肢动物肠道中被识别，它们所属的Bathyarchaeia类广泛发现于缺氧地下环境如海洋和热泉沉积物。Bathyarchaeia具有多样能力，包括有机化合物代谢、无机碳同化和厌氧甲烷代谢。ANME-1科在大多数样本中相对丰度低（<1%），除加热海湾深层沉积样本（15 cm：2.9±1.1%；22 cm：3.5±1.6%），该科的差异丰度分析显示加热海湾8和15 cm深度沉积样本ASV计数显著增加（p<0.05）（图6，进一步统计结果见补充表S5）。ANME-1是一种厌氧甲烷氧化古菌，在海洋沉积物AOM中起重要作用。DHVEG-1是另一甲烷氧化科，也在其他沉积物中发现，在对照海湾0 cm处相对丰度低（2.9±1.6%），逐渐增加直至22 cm峰值相对丰度（16.3±1.3%）。相反，DHVEG-1在加热海湾浅层深度相对丰度高（0 cm：7.1±1.3%；1 cm：10.0±2.8%），后在22 cm降至3.8±2.3%。BA1也是Bathyarchaeia类成员，基因组重建表明它包含与产甲烷作用相关的基因。BA1在对照海湾相对丰度低（<1%）直至最深深度（22 cm：1.01±0.02%），而加热海湾其相对丰度从8 cm深度向下增加（8 cm：1.04±0.06%；15 cm：1.8±0.4%；22 cm：2.9±0.6%）。另一产甲烷科Methanomethylophilaceae也在沉积样本中发现，但两海湾所有深度相对丰度均低（<1%）。此外，Nitrosopumilaceae科在浅层深度如对照海湾0 cm样本相对丰度高（28.1±10.0%）。Nitrosopumilaceae是海洋生态系统相关的厌氧铵氧化菌，耦合亚硝酸盐还原。HEL-GB-A科在所有深度（除22 cm外）加热海湾相比对照海湾ASV计数持续显著增加（0-15 cm：p<0.05）。HEL-GB-A科属于Helarchaeales taxon，在其他盆地沉积样本中发现，具有在厌氧环境中激活和氧化热液生成的短链烃的潜力。

三个硫酸盐还原Desulfobacterota科在 top 15相对丰度细菌种群中发现。第一个是UBA11574科，在对照海湾0 cm、1 cm和15 cm深度总体显著丰度增加（p<0.01；图6，进一步统计结果见补充表S5）。其峰值相对丰度也在对照海湾更深（15 cm：6.0±0.3%）相比加热海湾（8 cm：2.8±0.1%）。第二个Desulfobacterota科是Desulfatiglandaceae，在两海湾浅层深度相对丰度低（<1%）。然而，峰值相对丰度再次在加热海湾更浅出现（15 cm：2.0±0.4%）相比对照海湾（22 cm：3.2±0.2%）。最后，Desulfocapsaceae与前两个科趋势相反，在0 cm相对丰度最高（对照海湾：3.4±0.8%；加热海湾：3.7±0.2%），在22 cm最低（两海湾均<1%）。硫氧化Thiobacillaceae科在对照海湾相对丰度峰值深度更深（1 cm最低：3.3±0.5%；15 cm最高：5.4±0.5%）相比加热海湾（0 cm最高：2.8±0.4%），差异丰度分析也显示15 cm和22 cm深度ASV计数增加（p<0.05）。最后，34–128科在两海湾浅层深度相对丰度低（<1%），但加热海湾深层深度相对丰度更高（15 cm：4.3±1.4%；22 cm：7.1±2.4%）相比对照海湾（15 cm：1.0±0.1%；22 cm：2.8±0.4%）。34–128科是Atribacteria中JS1类的成员，发现主导产甲烷 slurry细菌群落，可能是预测执行碳水化合物初级发酵的异养厌氧菌。出乎意料，top 15最丰富科中未发现与其他电子受体（如铁或锰）相关的类群，可能由于这些微生物丰度低，被分类在“other_families”组中。

冬季总结而言，产甲烷古菌（如BA1）以及建议执行AOM的种群（如ANME-1和DHVEG-1）在加热海湾相比对照海湾更浅深度相对丰度增加。这支持加热海湾相比对照海湾更浅深度更高甲烷浓度。对于细菌种群，硫酸盐还原科UBA11574在对照海湾所有深度相对丰度增加和更深峰值相对丰度支持了硫酸盐和甲烷测量。这表明对照海湾SMTZ更深，与本研究点先前数据一致。最后，作为异养厌氧菌的Atribacteria 34–128科在加热海湾更浅深度相对丰度增加，也支持该海湾硫酸盐-甲烷转换区变浅。

3.6 基于16S rRNA基因的夏季群落

夏季，两个最主导古菌科也是来自Bathyarchaeia类的TCS64和UBA233，它们的相对丰度分布遵循与冬季相似的模式（图6）。两个产甲烷科也与冬季趋势相似，Methanomethylophilaceae科所有深度相对丰度低（<1%），而BA1从加热海湾8 cm向下相对丰度增加（8 cm：1.7±0.4%；15 cm：1.9±0.7%；22 cm：1.9±0.8%）。然而，夏季所有深度BA1科的差异丰度分析无显著差异。类似冬季，DHVEG-1科在对照海湾随深度增加（从0 cm：2.3±0.1%至22 cm：6.7±1.1%）。然而，其相对丰度在加热海湾更浅深度8 cm（1.2±0.4%）相比冬季22 cm降低。与冬季相反，Nitrosopumilaceae科在加热海湾浅层深度相对丰度增加，差异丰度分析结果支持（p<0.05）。最后，HEL-GB-A科在大多数深度相对丰度低（<1%），夏季海湾间无显著丰度差异。

对于来自Desulfobacterota门的硫酸盐还原细菌，大多数种群夏季与冬季模式相似。主要差异是34–128科，在加热海湾沉积物15 cm（16.9±14.4%）和22 cm（18.1±12.7%）相对丰度大幅增加，相比浅层深度（如8 cm：7.1±5.0%）以及对照海湾沉积物（15 cm：4.6±1.0%；22 cm：4.8±0.9%）。差异丰度分析结果也显示加热海湾所有深度（除8 cm外）34–128科ASVs显著丰度增加。如前，top 15最丰富科未显示与已知利用其他电子受体的类群清晰连接。

总体而言，夏季基于16S rRNA基因的微生物群落在海湾间比较冬季差异更少。观察到的主要变化是甲烷营养DHVEG-1科在加热海湾更浅沉积深度相对丰度降低，而34–128科在加热海湾深层沉积物相对丰度增加。这些发现支持相对硫酸盐通量和对照海湾SMTZ变浅。

3.7 微生物群落与地球化学关系

古菌和细菌群落的典范对应分析显示，增加的硫酸盐浓度与对照海湾相关，表明该海湾沉积物硫酸盐通量较低和硫酸盐还原区更深（图7）。硝酸盐作为重要电子受体，受加热和对照海湾沉积群落驱动，可能反映大多数硝酸盐在浅层沉积物已被消耗。有机质主要与较浅深度而非海湾身份的微生物群落相关。这一模式与其沿深度梯度而非海湾的显著相关性一致，表明两海湾 exhibit similar rates of organic matter degradation。亚铁(Fe2?)主要与浅层加热沉积群落相关。由于亚铁可作为缺氧条件的指标，它可能是加热海湾SMTZ变浅的结果。由于甲烷在不同深度采样，其他参数最近对应深度的值被用于包括甲烷的额外典范对应分析（补充图S5）。结果模式与其他地球化学剖面相似，甲烷朝向深层沉积物16S rRNA基因基于微生物群落。

4 结论

本研究揭示了长期变暖增加了波罗的海沿海区域海底甲烷释放的潜力，并改变了沉积物中的微生物群落结构。沉积物甲烷浓度在加热海湾夏季总体较高。结合硫酸盐通量结果，表明长期变暖可能通过甲烷厌氧氧化加速硫酸盐还原，导致加热海湾尤其是夏季SMTZ变浅。相应地