膳食寡糖通过调控细胞呼吸与氨基酸代谢通路改变沙门氏菌上皮细胞黏附的机制研究

本研究发现人乳寡糖（HMO）与甘露寡糖（MOS）通过差异调控宿主-病原体代谢互作（如TCA循环、氧化磷酸化）和毒力因子表达（SPI-1/2），显著抑制沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）上皮细胞黏附，揭示预 biotic作用的上下文依赖性及其对肠道感染的潜在调控价值。

　　

引言

膳食预 biotic寡糖作为支持有益菌的复杂碳水化合物，已在市场和日常饮食中广泛存在。然而，不同预 biotic在肠道感染过程中如何改变上皮细胞和微生物的相互作用尚不明确。本研究通过体外模型揭示两种结构不同的预 biotic寡糖——人乳寡糖（HMO）和甘露寡糖（MOS）在感染过程中以预 biotic特异性方式改变结肠上皮细胞和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica sv. Typhimurium）的代谢活动。

预 biotic预处理Caco2细胞降低沙门氏菌黏附

Caco2细胞经HMO或MOS预处理后，鼠伤寒沙门氏菌LT2的联合侵袭和黏附活性呈剂量依赖性降低。0.1% MOS处理使黏附降低59%（p < 0.02），而HMO在相同浓度下效果较弱（降低28%，不显著）。在0.5%浓度下，MOS和HMO分别降低54%和59%的菌体关联（p < 0.05）。1% HMO处理显著降低82%的关联（p < 0.02），而MOS在此浓度下效果减弱（降低44%，不显著）。结果表明，HMO随浓度增加而增效，MOS则反之。

沙门氏菌毒力因子和Caco2受体表达受预 biotic调控

基因表达分析显示，HMO处理显著诱导沙门氏菌特异性致病岛SPI-1（adj. p < 2.0×10^?6）和SPI-2（adj. p < 3.0×10^?5）的表达，而MOS处理增加菌毛表达（adj. p < 3.0×10^?3）。宿主和病原体代谢均被预 biotic改变：MOS诱导宿主细胞和沙门氏菌中氨基酸代谢基因表达，这一代谢转变在HMO处理中未观察到。MOS还使沙门氏菌呼吸代谢向肠道炎症期间典型活性转变。

沙门氏菌14028 s（与LT2 98%遗传相似）用于评估宿主-病原体互作。34/43（79.1%）毒力基因在HMO条件下诱导，而MOS仅诱导14/43（32.6%）。HMO处理中所有SPI-1和SPI-2基因均显著诱导，而MOS处理中多个SPI基因被抑制。菌毛基因表达亦呈差异模式：HMO诱导fimA、fimF、fimY和fimZ，MOS抑制fimF、fimI和fimZ但显著诱导fimY（log₂FC = 6.5, ?log₁₀P = 11.5），该基因编码甘露糖结合型1类菌毛。

双组分系统（TCS）表达分析显示，MOS处理中TCS转录本未被检出或抑制，而HMO处理中13个TCS均差异表达，多数抑制但应激响应TCS（如rpoS/rssB）和arcA受体被诱导。糖苷水解酶（如bcsC、bglX、nanH）在HMO处理中被抑制，MOS则抑制nagZ但诱导glgX和glgB。nanH和malS敲除实验证实这些唾液酸酶和淀粉酶对沙门氏菌侵入宿主细胞至关重要，而MOS处理意外挽救了这些敲除株的侵袭表型。

宿主表面受体表达亦受预 biotic调控：两种处理均诱导TLR2但抑制TLR1、3、4、5、6，且TLR信号蛋白MYD88被诱导，表明宿主通过表面介导接触调节细胞内活性。

预 biotic预处理调控Caco2细胞代谢通路表达

预 biotic预处理改变感染细胞代谢通路表达。HMO和MOS共同显著改变3745个基因，但MOS额外调控3533个独特基因。HMO处理诱导环氧角鲨烯 biosynthesis、精胺 biosynthesis和甲羟戊酸途径I（均涉及胆固醇 biosynthesis），并调节色氨酸降解（57%基因诱导）。MOS处理显示混合调控，如诱导神经酰胺 biosynthesis但抑制蛋白质瓜氨酸化。

代谢物富集分析显示，预 biotic处理导致更多显著富集通路（adj. p < 0.05）。无预 biotic时，细胞色素P450代谢异生物质为最显著富集通路（?Log₁₀P > 1.3），其次为甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和初级胆汁酸 biosynthesis。HMO处理细胞中前五通路为卟啉和叶绿素代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、半胱氨酸/蛋氨酸代谢、色氨酸代谢和嘌呤代谢；MOS处理中为色氨酸代谢、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸 biosynthesis、苯丙氨酸代谢、脂肪酸降解和延伸。

预 biotic处理驱动沙门氏菌代谢基因表达分化

沙门氏菌在HMO和MOS处理中显示相反表达模式：2107个基因共同显著改变，但HMO额外改变2713个独特基因。MOS富集50条代谢通路（如L-色氨酸 biosynthesis、L-亮氨酸 biosynthesis、L-精氨酸降解），HMO仅富集14条（如CDP-二酰甘油 biosynthesis和甘油降解通路）。MOS最显著富集通路涉及细胞呼吸和能量生产（如琥珀酸至细胞色素bd氧化酶电子传递、TCA循环），而HMO未富集这些通路。

代谢谱揭示预 biotic处理后宿主-病原体代谢协同转变

全细胞代谢谱显示预 biotic类型、病原体存在和采样时间均显著影响代谢聚类。预 biotic处理15分钟后（T0），代谢谱按预 biotic类型明显分离。T60时，沙门氏菌存在成为主要驱动因素，掩盖预 biotic效应。MOS处理中铁化合物（如 precorrin-4、钴-precorrin-2）和呼吸相关代谢物（如N₂-琥珀酰谷氨酸、嘧啶环）被调控。252种代谢物在所有条件和时间点显著差异（?log₁₀P > 1.3），表明代谢波动受时间和处理影响。

细胞呼吸通路受预 biotic依赖性调控

TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化在宿主和病原体中均被差异调控。Caco2细胞中TCA循环在两种处理中表达相似，但MOS诱导所有主要反应。沙门氏菌中，HMO处理显示不完全厌氧TCA循环（分裂为氧化和还原分支），MOS则表达更完整TCA循环但抑制异柠檬酸至 oxoglutarate、琥珀酸至延胡索酸和苹果酸至草酰乙酸反应，推动琥珀酸生产。

PPP调控亦呈预 biotic特异性：MOS处理中沙门氏菌诱导PPP多步反应（如转醛缩酶），HMO抑制PPP beyond D-核酮糖-5-磷酸。氧化磷酸化相关基因在Caco2细胞中受调控：MOS抑制复合物I基因（如NDUFA3、NDUFA7），两种处理均抑制复合物IV。

讨论

预 biotic体外靶向应用以底物特异性方式改变宿主和病原体基因表达与代谢，修正了当前预 biotic通过共生菌 catabolism 和竞争排斥发挥保护作用的范式。尽管HMO和MOS均减少宿主关联，但其作用路径不同：HMO抑制糖苷水解酶和宿主表面可及性，MOS驱动氨基酸代谢和呼吸通路激活。预 biotic调控毒力因子（如SPI-1/2）、宿主受体（如TLR）和共享代谢的复杂协调表明其保护作用超越物理阻断。

HMO处理中CpxA抑制和ArcA诱导可能短暂推动沙门氏菌走向细胞死亡，且糖苷水解酶抑制限制其突破黏液屏障能力。MOS处理中琥珀酸生产、氨基酸代谢（如精氨酸、色氨酸）和氧化呼吸支持可能增强致病性。商业MOS的混合成分（如金属离子、氨基酸）可能导致脱靶效应，而纯化HMO效果更单一。

宿主代谢调控亦贡献保护作用：MOS缓和宿主免疫反应（如钙转运、脂质通路），但沙门氏菌入侵可能覆盖这些响应。色氨酸代谢调控（如L-犬尿氨酸富集）提示预 biotic可能通过宿主代谢调节产生全身效应。

总之，预 biotic有益效果依赖于健康肠道环境，且救援菌群失调或炎症肠道仅适用于特定寡糖。预 biotic调控侵袭和能量代谢的 diverging 效应强调需开展底物特异性研究 across 不同肠道环境。