利用CRISPR/Cas9与Cas3系统精准调控水稻拷贝数变异（CNV）以改良农艺性状

本研究创新性地采用CRISPR/Cas9（通过胞嘧啶延伸sgRNA策略）和Cas3（诱导大片段缺失）两种基因组编辑技术，成功实现对水稻OsGA20ox1和OsMTD1基因拷贝数变异（CNV）的精准调控。研究证实OsGA20ox1拷贝数与幼苗活力呈正相关，为通过CNV编辑定向改良作物性状提供了关键技术路径和理论依据。

　　

引言：拷贝数变异（CNV）作为基因组结构变异的关键组成部分，在植物育种中具有重要作用，但其对农业性状的具体影响尚未明确。本研究通过两种基因组编辑技术——CRISPR/Cas9和Cas3，在水稻中调控CNV，以阐明CNV的影响并进一步利用其改良相关农艺性状。

材料与方法：从水稻资源中心数据库提取了1,003个在品种日本晴（Nipponbare）和越光（Koshihikari）间存在CNV的基因，最终选择与农艺性状密切相关的OsGA20ox1（赤霉素20-氧化酶基因）和OsMTD1（分蘖相关基因）作为靶基因。通过序列比对确认这两个基因所在的基因块（13-37 kb）具有高度序列相似性（>99.94%），这使得传统CRISPR/Cas9编辑面临挑战。

研究采用两种策略：策略I通过在sgRNA的5′端添加30个胞嘧啶（C30+sgRNA）降低Cas9编辑效率，实现部分等位基因突变；策略II利用Cas3核酸酶诱导大尺度缺失，减少基因拷贝数。通过农杆菌介导转化获得转基因水稻，并采用液滴数字PCR（ddPCR）、Sanger测序、长片段PCR（LR-PCR）和TIDE分析等方法验证编辑效果和拷贝数变化。

结果：

基因组编辑策略用于CNV修饰：重新注释和序列比较显示，OsGA20ox1和OsMTD1基因块存在多重拷贝，且各拷贝间序列几乎完全相同。针对这种高相似性，提出了C30+sgRNA/Cas9（策略I）和CRISPR/Cas3（策略II）两种编辑策略。

基因组编辑策略I：使用带有30个胞嘧啶延伸的sgRNA：在日本晴（OsGA20ox1单拷贝）中，C30+sgRNA/Cas9显著降低了编辑效率，双等位突变比例从70%降至40%。在越光（实际有3个OsGA20ox1拷贝）中，C30+sgRNA编辑使三拷贝完全双等位突变的比例从50%降至10%，增加了功能等位基因数量的多样性。通过克隆测序和卡方拟合优度检验，证实越光中OsGA20ox1拷贝数为3而非先前报道的2。

通过等位基因类型多样化高效筛选CNV调控株系：针对多拷贝基因，提出了高效的后代筛选策略：选择功能等位基因数为1或5的T0植株，可在T1代以约25%的理论分离比获得纯合CNV修饰株系。表型分析显示，OsGA20ox1拷贝数与幼苗叶鞘长度呈正相关，证明CNV是水稻幼苗活力的决定因素。

通过错配引物建立CNV修饰株系的定量筛选方法：针对Cas9诱导突变多位于PAM序列上游3 bp的特点，设计了在引物3′端引入错配的ddPCR方法，可准确量化功能等位基因数量。该方法显示功能等位基因数量与ddPCR相对值呈阶梯式变化，野生型越光（3拷贝）的相对值约为日本晴（1拷贝）的3倍。

基因组编辑策略II：通过Cas3核酸酶诱导大片段缺失：Cas3编辑在日本晴（OsMTD1双拷贝）中成功诱导了缺失，15.2%的T0株系显示拷贝数减少。LR-PCR和测序证实缺失大小为3.6-8.5 kb，部分株系实现纯合缺失。通过ddPCR基因分型，在T1代成功筛选到CNV修饰纯合株系。

讨论：

利用新兴基因组编辑技术进行CNV修饰：C30+sgRNA策略通过降低Cas9效率实现部分突变，适用于精细调控基因剂量；Cas3策略则通过大片段缺失直接减少拷贝数。两种策略各有优势，应根据研究目标和CNV结构选择适用方案。

基因组编辑植株的拷贝数评估：结合TIDE分析和错配引物ddPCR，可准确鉴定CNV修饰株系。尽管ddPCR值存在轻微波动，但两种方法交叉验证可提高可靠性。

CNV修饰对农艺性状的影响：本研究证实越光中OsGA20ox1拷贝数为3，其CNV差异（而非SNP）是幼苗活力的决定因素。这与番茄SlKLUH等基因的研究一致，表明CNV通过调控基因表达影响表型。

基因组编辑介导的CNV修饰在育种中的应用：提出了功能等位基因选择数（FAS）模型和计算公式FAS(x)=2x±1（0<><>

结论：本研究成功利用CRISPR/Cas9和Cas3技术调控了水稻CNV，证明了CNV对农艺性状的影响，并建立了高效筛选策略，为作物育种中利用CNV进行遗传改良提供了新方法。