去甲肾上腺素通过受体脱敏诱导支持细胞铁死亡进而导致应激相关男性生殖功能障碍

本文揭示了心理应激通过激活交感神经系统释放去甲肾上腺素（NE），诱导睾丸支持细胞发生铁死亡（ferroptosis）的新机制。研究发现NE通过β-肾上腺素能受体（β-ARs）过度激活引发受体脱敏，进而抑制CREB1/GPX4通路，导致脂质过氧化和细胞死亡。该研究为应激相关男性不育提供了新的治疗靶点（如β-ARs阻断剂propranolol和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1），具有重要临床意义。

　　

心理应激诱导雄性大鼠生殖损伤

通过建立慢性不可预见温和应激（CUMS）结合社会隔离的大鼠模型，研究发现21天的应激暴露显著损害了大鼠的体重增长，降低了蔗糖偏好，并激活了下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴。应激诱导的生殖功能损伤表现为睾丸器官系数降低、生精小管组织病理学改变、精子密度降低和DNA碎片化增加。同时，血清中的促性腺激素释放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和睾酮（T）水平均显著下降。这些结果表明心理应激对雄性生殖系统造成了全面损害。

支持细胞铁死亡介导应激诱导的生精功能下降

支持细胞（Sertoli cells）是生精上皮中的体细胞，为生殖细胞发育提供结构和代谢支持。研究发现，应激导致睾丸中支持细胞标志物（如WT1和SOX9）表达显著减少，表明细胞数量丢失。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现，应激组支持细胞中铁死亡和谷胱甘肽代谢通路显著富集。基因本体（GO）分析显示，与谷胱甘肽代谢、金属离子应答、脂质转运和氧化应激相关的生物过程显著富集。关键铁死亡调控因子GPX4的表达在应激条件下急剧下降。

进一步的验证实验表明，应激睾丸组织中出现了铁死亡的特征性变化：亚铁离子（Fe²⁺） overload和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）积累增加；GPX4和SLC7A11蛋白表达下调，而ACSL4表达上调。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）处理能够显著缓解应激诱导的生精功能损伤，维持支持细胞数量和功能标志物，并改善铁死亡相关指标。这些发现表明心理应激通过诱导支持细胞铁死亡而损害生精功能。

去甲肾上腺素通过β-肾上腺素能受体激活介导应激诱导的支持细胞铁死亡

研究发现心理应激导致大鼠血清和睾丸中的去甲肾上腺素（NE）水平显著升高，不孕且伴有心理应激的男性患者血清NE水平也明显升高。通过NE注射实验发现，NE暴露能够模拟心理应激的表型，导致体重增长缓慢、蔗糖偏好降低、生精小管损伤、睾丸器官系数和精子密度下降。β-ARs阻断剂普萘洛尔（propranolol）能够显著减轻这些应激诱导的不良效应。

在机制上，NE暴露显著减少了支持细胞数量，提高了睾丸中的脂质过氧化水平和亚铁离子水平。Western blot分析显示，NE和应激处理均下调了GPX4和SLC7A11的表达，而上调了ACSL4的表达。紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-11的表达也显著降低，表明支持细胞功能受损。普萘洛尔处理能够有效预防应激诱导的铁死亡和支持细胞功能障碍，表明应激导致的NE水平升高通过β-ARs激活引起支持细胞铁死亡。

去甲肾上腺素诱导TM4细胞铁死亡

使用小鼠支持细胞系TM4进行体外实验，发现NE暴露以时间依赖性的方式降低细胞数量和活力。Calcein-AM/PI双染色显示NE处理增加了死亡细胞比例。细胞内亚铁离子积累显著增强，线粒体膜电位大幅降低，表明线粒体功能受损。同时，活性氧（ROS）和MDA水平显著增加，表明脂质过氧化增强。Western blot分析证实了铁死亡相关的特征性变化：SLC7A11和GPX4下调，ACSL4上调。免疫荧光染色进一步在细胞水平证实了这些铁死亡标志物的表达。此外，NE暴露损害了支持细胞屏障相关蛋白ZO-1和Claudin-11的表达。

使用铁死亡抑制剂Fer-1进行挽救实验，发现Fer-1能够逆转NE诱导的细胞活力下降和细胞数量减少，降低死亡细胞比例。Fer-1处理减轻了铁死亡的关键特征：ROS、MDA、亚铁离子水平和线粒体膜电位恢复至对照水平。Western blot分析表明Fer-1使铁死亡调控因子的表达正常化，挽救了NE介导的SLC7A11和GPX4抑制，并减少了ACSL4的过表达。免疫荧光染色显示Fer-1逆转了NE诱导的ACSL4上调和GPX4下调。此外，ZO-1和Claudin-11的表达也通过Fer-1处理得到恢复，表明铁死亡导致了支持细胞功能障碍。

β₁和β₂-肾上腺素能受体介导去甲肾上腺素诱导的铁死亡

体内实验表明抑制β-ARs能够显著减轻心理应激诱导的雄性生殖损伤和铁死亡。使用选择性拮抗剂：阿替洛尔（ATN，β₁-AR特异性）和ICI118551（ICI，β₂-AR特异性）进行实验，发现两种受体阻断剂均能有效挽救NE诱导的支持细胞活力下降和细胞数量减少。抑制任一种受体亚型都能减轻NE诱导的细胞死亡增加、抑制脂质过氧化、减弱ROS过量产生，并恢复细胞内亚铁离子浓度和线粒体膜电位。免疫荧光染色表明ATN或ICI逆转了NE诱导的ACSL4表达增加和GPX4表达减少。同时，阻断β₁-或β₂-AR逆转了NE诱导的SLC7A11、GPX4和ACSL4表达变化。紧密连接标志物ZO-1和Claudin-11的蛋白水平也通过受体阻断恢复正常，恢复了支持细胞屏障功能。这些结果表明β₁-和β₂-AR共同介导NE诱导的支持细胞铁死亡信号。

去甲肾上腺素通过β-肾上腺素能受体脱敏抑制CREB1和GPX4表达

经典NE信号通路涉及β-ARs激活，触发cAMP依赖性通路调控CREB1转录活性。研究发现NE暴露虽然上调了β₁-和β₂-AR的mRNA水平，但Western blot显示总受体蛋白和膜定位受体蛋白 paradoxical 减少，同时CREB1蛋白下调。时间进程分析表明，膜β₁-AR和β₂-AR蛋白在12-36小时逐渐增加，但在48小时显著下降。铁死亡相关蛋白ACSL4在12和24小时显著升高，在36小时恢复基线，在48小时再次增加；而SLC7A11和GPX4在48小时显著下调。

免疫荧光共定位分析显示，NE处理促进了受体内化，表现为β-ARs与早期内体标志物EEA1的共定位增加；到48小时，β-ARs与溶酶体标志物LAMP1的共定位增强，表明溶酶体靶向和降解。这一过程与总β-ARs蛋白水平的显著减少相一致，表明 prolonged NE暴露通过内体-溶酶体途径诱导受体脱敏和降解。

β-arrestin1是G蛋白偶联受体（GPCR）脱敏和信号传导的关键调控因子，在NE暴露后表达上调。NE还增强了抑制性G蛋白（Gi）特别是Gi2的转录，这在蛋白水平得到证实。Gi偶联受体信号对CREB1激活的抑制作用已得到充分证实；Gi激活抑制腺苷酸环化酶活性，降低细胞内cAMP水平，从而下调PKA/CREB信号级联。

通过siRNA介导的敲低实验进一步验证了β-arrestin1和Gi2在介导CREB1抑制和铁死亡信号中的作用。敲低β-arrestin1逆转了NE诱导的β-arrestin1和Gi2上调，并恢复了CREB1以及铁死亡相关标志物ACSL4、SLC7A11和GPX4的表达。类似地，Gi2敲低有效抑制了NE诱导的Gi2和ACSL4表达，同时挽救了CREB1、SLC7A11和GPX4水平。这些结果强调了β-arrestin1和Gi2在β-ARs过度激活驱动的CREB1抑制和铁死亡中的关键作用。

此外，用阿替洛尔或ICI118551阻断β-ARs逆转了NE诱导的脱敏和CREB1下调。体内验证表明，应激通过NE过度激活β-ARs，导致β-ARs和CREB1下调，同时伴随β-arrestin1和Gi2升高。CREB1是GPX4的转录调控因子，其敲低会引发铁死亡。研究发现CREB1敲低降低了GPX4的mRNA和蛋白水平，而不改变ACSL4或SLC7A11水平。相反，CREB1过表达增加了GPX4表达。这些结果表明，升高的NE通过β-arrestin1介导的β-ARs脱敏和Gi2上调，抑制了CREB1依赖的GPX4转录，导致支持细胞铁死亡。

讨论

本研究揭示了心理应激诱导的交感神经过度激活是男性生殖功能障碍的关键驱动因素，通过持续NE升高驱动的β-ARs过度激活破坏了睾丸氧化还原稳态。β-arrestin1依赖的受体脱敏导致Gi蛋白介导的CREB1/GPX4抗氧化通路抑制，引发支持细胞铁死亡。这些发现建立了连接神经应激反应与生殖功能障碍的神经内分泌-铁死亡轴，表明靶向β-ARs调控可能为慢性应激下保存生精功能提供潜在策略。