靶向TSHR核酸适体YC3通过新型变构抑制治疗Graves眼病

本文报道了一种靶向促甲状腺激素受体（TSHR）的核酸适体YC3，通过创新性的变构抑制机制有效改善Graves眼病（GO）的病理进程。研究结合蛋白靶向细胞-SELEX与功能筛选技术，证实YC3能以纳摩尔级亲和力结合TSHR富含亮氨酸重复域（LRD）的新型变构位点，抑制cAMP/ERK信号通路，在体外逆转甲状腺刺激抗体（TSAb）驱动的眶周成纤维细胞活化，在动物模型中显著缓解眼部症状，为GO的机制驱动型治疗提供了新策略。

　　

2.1 筛选与鉴定具有抑制功能的TSHR靶向适体

研究采用蛋白靶向细胞-SELEX与功能性筛选相结合的策略，以稳定表达TSHR的HEK293T细胞（TSHR-293T）为正选细胞，空载体转染细胞（MOCK）为负选对照组。经过9轮筛选后，通过流式细胞术检测到ssDNA库与TSHR-293T细胞的结合信号显著增强。高通量测序鉴定出6个家族，从中选出8个代表性序列（YC1-YC8）进行功能验证。流式细胞术显示所有候选适体均能特异性结合TSHR-293T细胞，其中YC3在M22（人TSAb单抗）刺激下显著抑制细胞内cAMP水平及ERK1/2磷酸化，并呈剂量依赖性抑制MEK磷酸化，表明YC3具有抑制TSHR信号通路的潜力。

2.2 YC3的优化、表征与修饰

通过NUPACK软件预测YC3二级结构并进行截短设计，发现全长YC3结构对其高亲和力至关重要。流式细胞术测定YC3对TSHR-293T细胞的平衡解离常数（K_d）为259.90 ± 29.57 nM，且在37°C下的结合能力强于4°C。胰蛋白酶和蛋白酶K处理证实YC3靶点位于细胞膜表面，且YC3在12小时内未内化入细胞。为提高稳定性，对YC3进行硫代磷酸化修饰和PEG化（PS-YC3-PEG），修饰后分子量增加、血清稳定性增强，且不影响结合能力。竞争性结合实验表明YC3与PS-YC3-PEG结合位点相同。

2.3 验证TSHR为YC3的结合靶点

通过TSHR特异性siRNA敲低Nthy-ori 3-1细胞中TSHR表达后，YC3结合能力显著降低。流式细胞术检测多种细胞系膜TSHR表达水平，发现YC3结合强度与TSHR表达呈正相关（Pearson相关系数0.9245）。适体pull-down实验证实YC3可直接结合TSHR蛋白，表面等离子共振（SPR）测定其K_D为11.74 nM，结合速率常数（k_on）为7.686×10⁴ M^?1s^?1，解离速率常数（k_off）为9.023×10^?4 s^?1。

2.4 YC3通过变构位点与TSHR相互作用

竞争结合实验表明YC3与M22结合位点不重叠。分子对接与动力学模拟显示YC3结合于TSHR-LRD的凸面（而非M22结合的凹面），关键相互作用残基包括T190、Q193、K218等。点突变实验证实K218A突变对结合影响最大。圆二色谱（CD）显示YC3结合导致TSHR-LRD的β-片层结构含量降低，表明其诱导构象重排。这些结果证实YC3通过新型变构机制抑制TSHR激活。

2.5 YC3的靶向特性与体内性质

Graves眶周成纤维细胞（GOFs）中TSHR表达显著高于正常对照（NOFs），且YC3对GOFs的K_d为99.23 ± 17.95 nM。脂肪分化后GOFs的TSHR表达进一步上调，YC3结合增强。共聚焦显微镜显示YC3与TSHR抗体在GO患者眶周组织中显著共定位。小鼠眶周注射Cy5标记的YC3后，荧光信号在眶周和甲状腺区域特异性富集，而对照Library主要分布于肾脏、肝脏和肺。药代动力学分析显示修饰后YC3的分布半衰期（t_{1/2, α}）为0.25 ± 0.06 h，消除半衰期（t_{1/2, β}）为8.90 ± 1.64 h，表现出良好的清除特性。

2.6 YC3改善眶周成纤维细胞的疾病表型

在M22刺激的GOFs中，YC3以IC₅₀=1.77 μM抑制cAMP产生，并减弱NF-κB p65核转位。YC3显著降低IL-6、IL-8、IL-1β的mRNA和蛋白水平，以及HAS1表达和透明质酸（HA）合成，效果与临床药物Teprotumumab相当。YC3还抑制M22诱导的肌动蛋白纤维形成和脂肪分化，下调脂滴积累及脂肪生成标志物C/EBPα和PPARγ蛋白表达。

2.7 YC3改善Graves眼病小鼠模型结局

通过腺病毒Ad-TSHR289免疫构建GO小鼠模型，证实血清T3、T4和TRAb水平升高，并出现眼睑增宽、充血等症状。MRI显示眼外肌肥厚和眶周组织炎症。眶周注射YC3后，小鼠血清甲状腺激素水平降低，眶周炎症和脂肪组织扩张减轻，胶原和糖原沉积减少，纤维化标志物α-SMA、胶原III和IL-6表达下调。主要器官H&E染色未发现病理改变，表明YC3具有良好的短期安全性。

本研究首次开发出靶向TSHR的核酸适体YC3，通过变构抑制机制有效阻断TSHR信号通路，在细胞和动物水平均证实其治疗潜力，为Graves眼病的精准治疗提供了新策略。