FBXO44通过AURKA介导的FOXP1磷酸化降解促进结直肠癌进展的机制研究

本研究发现FBXO44在结直肠癌（CRC）中作为致癌基因通过泛素-蛋白酶体途径降解肿瘤抑制因子FOXP1。机制上，AURKA激酶磷酸化FOXP1的Ser440位点，增强其与FBXO44的结合，介导K48连接的泛素化降解，从而解除FOXP1对Cyclin E2的转录抑制，促进细胞增殖。该研究揭示了FBXO44/AURKA/FOXP1/Cyclin E2信号轴在CRC中的关键作用，为靶向治疗提供了新策略。

　　

FBXO44在结直肠癌组织中高表达且与不良预后相关

通过TCGA和GEO数据库分析发现，FBXO44在结直肠癌组织中的mRNA和蛋白表达水平显著高于正常组织。研究团队收集的80对CRC临床样本（队列1）验证了FBXO44 mRNA在肿瘤组织中的上调趋势。组织芯片（TMA）分析显示，50对CRC样本（队列2）中FBXO44蛋白表达显著升高，免疫组化评分明显增加。Western blot结果进一步证实CRC组织中FBXO44蛋白水平升高，而FOXP1蛋白水平降低，Cyclin E2表达增加。临床病理特征分析表明，FBXO44高表达与肿瘤大小、T分期和血管浸润呈正相关。生存分析显示，FBXO44高表达患者总体生存期显著缩短。体外实验表明，在CRC细胞系中FBXO44的表达普遍高于正常结肠上皮细胞NCM460，免疫荧光显示FBXO44主要定位于细胞核。

FBXO44促进结直肠癌细胞体外增殖

通过在FBXO44高表达的HCT116和RKO细胞中敲低FBXO44，以及在低表达的HT-29和DLD-1细胞中过表达FBXO44，研究发现敲低FBXO44显著抑制细胞增殖、克隆形成能力和EdU掺入率，而过表达则产生相反效应。流式细胞术分析表明，FBXO44敲低引起G0-G1期阻滞并增加细胞凋亡率，而过表达则促进S期进程并减少凋亡。这些结果证明FBXO44在体外显著增强CRC细胞的增殖能力。

FBXO44促进体内肿瘤生长和类器官形成

通过裸鼠皮下移植瘤实验发现，敲低FBXO44显著抑制肿瘤生长和重量，而过表达则促进肿瘤增殖。免疫组化显示FBXO44敲低组Ki-67表达降低，而过表达组Ki-67表达增加。在AOM/DSS诱导的结肠癌模型中，FBXO44敲低延缓了癌变进程，表现为体重增加、结肠长度缩短、肿瘤病灶减少和组织损伤减轻。相反，过表达FBXO44促进了结肠癌发展。患者来源类器官（PDOs）实验表明，FBXO44敲低减少类器官数量，而过表达促进类器官形成。这些结果证实FBXO44在体内显著促进肿瘤发生和发展。

FBXO44与FOXP1相互作用并促进其降解

通过Co-IP和质谱分析，研究发现FOXP1是FBXO44的主要相互作用蛋白。免疫组化显示FOXP1在CRC组织中表达降低，且与良好预后相关。分子对接预测和实验验证证实FBXO44与FOXP1直接结合，且主要发生在细胞核内。结构域分析表明，FBXO44的FBA结构域和FOXP1的中段区域是相互作用的关键区域。功能实验显示，FBXO44敲低增加FOXP1蛋白水平，而过表达降低FOXP1蛋白水平，且这种调控具有剂量依赖性，但不影响FOXP1 mRNA表达。蛋白酶体抑制剂MG132处理可逆转FBXO44对FOXP1的下调作用。蛋白质半衰期实验表明，FBXO44敲低延长FOXP1半衰期，而过表达缩短其半衰期。这些结果证明FBXO44通过泛素-蛋白酶体途径促进FOXP1降解。

FBXO44催化FOXP1在K377位点的K48连接泛素化

研究发现FBXO44作为SCF复合物的适配体，与CUL1协同作用促进FOXP1泛素化。体内外泛素化实验表明，FBXO44敲低减少FOXP1泛素化，而过表达增加泛素化水平。F-box结构域缺失突变体（ΔF-box）失去促进泛素化的能力。特异性泛素突变体实验证明FBXO44介导K48连接的多聚泛素化。通过位点预测和突变体验证，发现K377是FOXP1泛素化的关键位点，K377R突变体泛素化水平显著降低且蛋白稳定性增加。这些结果表明FBXO44特异性催化FOXP1在K377位点的K48连接泛素化。

FBXO44以FOXP1依赖的方式促进结直肠癌发展

通过回复实验发现，敲低FOXP1可逆转FBXO44敲低引起的细胞增殖抑制，而过表达FOXP1则逆转FBXO44过表达的促增殖效应。类似结果在克隆形成、EdU染色、细胞周期和凋亡实验中得到验证。动物实验表明，FOXP1敲低可逆转FBXO44敲低对移植瘤生长的抑制，反之亦然。这些证明FBXO44主要通过调控FOXP1促进CRC发展。

AURKA介导的FOXP1磷酸化促进其被FBXO44泛素化降解

碱性磷酸酶处理实验表明FBXO44与FOXP1的结合依赖FOXP1的磷酸化状态。AURKA在CRC组织中高表达，且与FOXP1存在直接相互作用和核内共定位。过表达AURKA增加FOXP1磷酸化，而抑制剂Alisertib处理降低磷酸化水平。位点突变实验证实S440是AURKA磷酸化的关键位点，S440A突变体磷酸化水平降低且稳定性增加。敲低AURKA抑制FBXO44与FOXP1的结合，延长FOXP1半衰期，并减少FBXO44介导的泛素化。S440A突变显著减弱AURKA增强的FBXO44-FOXP1相互作用和泛素化。这些结果表明AURKA通过磷酸化FOXP1的S440位点促进其与FBXO44结合和降解。

AURKA抑制剂Alisertib可逆转FBXO44过表达驱动的结直肠癌进展

Alisertib处理显著抑制FBXO44过表达引起的细胞增殖、克隆形成和EdU掺入增加，并诱导G0-G1期阻滞和细胞凋亡。在移植瘤模型中，Alisertib逆转FBXO44过表达导致的肿瘤生长加速、重量增加和Ki-67表达升高。类器官实验同样表明Alisertib抑制FBXO44过表达促进的类器官形成。这些证明靶向AURKA可有效抑制FBXO44的致癌功能。

FBXO44通过降解FOXP1增强Cyclin E2转录活性

荧光素酶报告基因实验显示，敲低FOXP1增加Cyclin E2启动子活性，而过表达降低其活性。ChIP实验证明FOXP1直接结合Cyclin E2启动子区域。qPCR和Western blot表明FOXP1敲低增加Cyclin E2表达，而过表达降低其表达。回复实验证实FBXO44通过调控FOXP1影响Cyclin E2转录和表达。临床样本和动物模型中也观察到FBXO44、FOXP1和Cyclin E2的表达相关性。这些结果表明FBXO44-FOXP1轴通过调控Cyclin E2转录影响CRC进展。