PSMD14介导的LDHA去泛素化通过H3K18乳酸化上调ACLY表达促进脂质合成与胰腺癌进展

本研究发现去泛素化酶PSMD14通过稳定乳酸脱氢酶A（LDHA）增加乳酸积累，诱导组蛋白H3K18位点乳酸化（H3K18la）修饰，进而转录激活ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）表达，促进脂肪酸合成代谢和胰腺癌（PC）恶性进展。研究揭示了泛素化修饰与脂质代谢重编程的新型交叉调控机制，为胰腺癌治疗提供了PSMD14/LDHA/ACLY轴这一潜在治疗靶点。

　　

1 引言

胰腺癌（PC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，其发病率以每年约1%的速度增长，预计到2030年将成为全球癌症相关死亡的第二大原因。由于早期症状隐匿且缺乏有效的筛查方法，多数患者确诊时已处于晚期或发生远处转移，丧失了根治性手术的机会。尽管近年来免疫治疗取得进展，但胰腺癌患者的生存率并未显著提高，其死亡率仍是恶性肿瘤中最高的之一。复杂的代谢重编程，包括异常的糖酵解激活、谷氨酰胺依赖和脂质代谢失衡，参与了胰腺癌的发病机制。这些适应性变化共同驱动了肿瘤的快速进展和治疗抵抗。

异常脂质代谢在胰腺癌中尤为突出。癌细胞需要大量能量供应以支持其快速增殖，而脂质是促进癌细胞增殖的重要能量来源。脂质分子不仅为癌细胞的快速增殖提供必需的能量载体（ATP）和生物膜成分，而且脂质代谢衍生的信号分子（如溶血磷脂酸和前列腺素）可进一步导致免疫细胞功能障碍并诱导化疗抵抗。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）在调节蛋白质稳定性方面发挥着重要作用，而UPS功能异常可破坏细胞内稳态并支持肿瘤发生。新兴证据表明，泛素化是细胞脂质代谢中的一个重要过程。去泛素化酶（DUBs）作为蛋白质稳态的核心调控因子，通过逆转底物蛋白的泛素化来调节其功能和稳定性，从而在细胞信号传导、DNA损伤修复和代谢重编程等关键生物学事件中发挥重要作用。

PSMD14（POH1）是JAMM超家族的成员，是一种去泛iquit化酶。作为26S蛋白酶体的重要亚基，PSMD14不仅参与DNA损伤修复、基因组转录调控、肿瘤化疗耐药和细胞衰老等关键细胞过程，还被证明通过去泛素化稳定MYC，驱动腺泡-导管化生，这是胰腺导管腺癌发生所必需的过程。然而，PSMD14在胰腺癌脂质代谢重编程中的调控作用及其分子机制仍不清楚，这一研究空白亟需进一步探索。

2 结果

2.1 PSMD14促进PC细胞脂质沉积和脂肪酸合成

UPS紊乱在肿瘤细胞脂质代谢重编程中起着至关重要的作用。为了确定去泛素化酶与胰腺癌脂质代谢之间的联系，研究人员使用去泛素化酶数据库的数据进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。值得注意的是，去泛素化酶PSMD14与胰腺癌密切相关。

癌症基因组图谱（TCGA）数据分析显示，PSMD14在胰腺癌组织中显著上调，其高表达与患者不良预后相关。通过Western blotting和qRT-PCR在细胞系和胰腺癌组织中验证PSMD14表达，结果显示与配对癌旁正常组织相比，胰腺癌组织中PSMD14表达上调。类似地，培养的胰腺癌细胞系（AsPC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1和SW 1990）中的PSMD14表达显著高于人胰腺导管上皮细胞（HPDE6-C7）。

免疫组化（IHC）评分显示，胰腺癌组织中的PSMD14评分显著高于正常组织，且与临床分期、远处转移、神经侵袭和肿瘤分化相关。Cox比例风险回归模型确定PSMD14 IHC评分是胰腺癌预后的独立危险因素。Kaplan-Meier生存分析显示，PSMD14表达升高的患者总生存期显著缩短。

这些结果表明PSMD14在促进胰腺癌进展中发挥致癌作用，但研究人员尚未明确确定它是否通过影响脂质代谢来调节胰腺癌进展。为了阐明PSMD14上调与脂质积累之间的因果关系，研究人员构建了PSMD14过表达或敲低的稳定细胞系。

PSMD14过表达胰腺癌细胞的转录组数据基因集富集分析（GSEA）显示，PSMD14与脂质代谢过程密切相关。油红O染色显示，胰腺癌组织中的脂质沉积比 contiguous正常组织更多。随后在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中进行PSMD14过表达或沉默的进一步实验支持了这些观察结果。PSMD14过表达显著增加了胰腺癌细胞中的脂质积累，而PSMD14敲低则减少了脂质积累，这通过油红O和尼罗红染色证明。

透射电子显微镜（TEM）显示，PSMD14过表达导致脂滴数量增加，而PSMD14下调伴随脂滴数量减少。为了进一步验证这些发现，研究人员通过质谱进行了全局脂质组学分析，系统比较了PSMD14过表达胰腺癌细胞与空载体对照之间的脂质组成。热图分析显示，在67种差异最显著的脂质种类中，PSMD14过表达的PANC-1细胞在多个脂质类别中显示显著上调。

随后，研究人员测量了胰腺癌细胞中细胞内甘油三酯（TG）、游离脂肪酸和胆固醇的水平，以评估PSMD14对胰腺癌细胞脂质代谢的影响。结果显示，稳定过表达PSMD14的PANC-1和MIA PaCa-2细胞显示出比PSMD14敲低细胞显著更高的TG、游离脂肪酸和胆固醇水平。总之，这些发现支持PSMD14在调节胰腺癌细胞脂质代谢中的关键作用。

为了阐明PSMD14在脂质代谢调控中的作用，研究人员首先使用TCGA-PAAD转录组数据检查了其与关键脂肪酸合成酶的关联。生物信息学分析证明，PSMD14表达与ATP-柠檬酸裂解酶和乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）均呈显著正相关。随后，胰腺癌组织的多重免疫荧光分析证明，在PSMD14高表达的肿瘤区域中，ACLY和ACC1蛋白共同上调。这些结果进一步表明PSMD14在脂质代谢中发挥调控作用。

2.2 PSMD14促进体外和体内PC细胞增殖

为了评估PSMD14在胰腺癌发展中的生物学功能，研究人员检测了PSMD14对MIA PaCa-2和PANC-1细胞增殖的影响。EdU和CCK-8检测显示，降低PSMD14表达抑制了MIA PaCa-2细胞和PANC-1细胞的增殖，而增加PSMD14表达显著促进了胰腺癌细胞增殖。

此外，流式细胞术分析显示，PSMD14缺失导致MIA PaCa-2细胞和PANC-1细胞在G0/G1期的比例显著增加，而PSMD14过表达导致G0/G1期细胞比例显著减少。

为了进一步研究PSMD14在体内的致癌作用，研究人员将稳定过表达PSMD14和敲低PSMD14的PANC-1细胞皮下注射到裸鼠体内以建立异种移植肿瘤模型。体内研究表明，PSMD14沉默显著抑制了肿瘤形成，而PSMD14过表达加速了皮下肿瘤生长，这通过重量和肿瘤体积测量显示。随后对异种移植瘤的免疫组化染色显示，PSMD14过表达肿瘤中的Ki67和PCNA表达水平显著高于对照肿瘤，而PSMD14敲低肿瘤中的表达显著降低。

2.3 PSMD14与LDHA相互作用

为了探索去泛素化酶PSMD14调节胰腺癌细胞脂质合成的机制，研究人员首先通过Co-IP结合质谱分析鉴定了94个PSMD14的潜在蛋白结合伴侣。通过将这些潜在靶点与脂质代谢相关基因进行比较，研究人员发现LDHA可能是PSMD14调节脂质合成的效应分子。

为了表征LDHA和PSMD14的空间分布，研究人员在胰腺癌细胞中进行了亚细胞定位分析。免疫荧光共定位显示，LDHA和PSMD14在胰腺癌细胞的细胞核和细胞质中共定位。Co-IP实验证实内源性PSMD14与内源性LDHA共沉淀。随后，GST pull-down实验证明PSMD14和LDHA可以在体外相互作用。邻近连接 assay（PLA）进一步证实了PSMD14和LDHA在细胞中的直接相互作用。

免疫组化实验显示，LDHA表达在胰腺癌组织中高于癌旁正常组织。观察到胰腺癌组织中LDHA和PSMD14的IHC染色评分呈正相关。

PSMD14蛋白由N端推定泛素结合结构域（UBD）、MPN结构域（去泛素化催化结构域）和C端结构域组成。为了分析LDHA与PSMD14之间的相互作用，研究人员创建了缺失构建体。结果表明，PSMD14的UBD对于其与LDHA的相互作用至关重要，而LDHA与PSMD14的相互作用是由LDHA的C端结构域介导的。

此外，计算建模用于进一步分析PSMD14和LDHA之间的相互作用机制。分子对接结果显示，PSMD14和LDHA之间的蛋白-蛋白对接评分为-278.13，并且在PSMD14的SER79和LDHA的PHE332之间形成了氢键相互作用，氢键距离为3.2?。PSMD14蛋白中的TYR32、LEU181和LEU184残基与LDHA蛋白中的PRO154、PHE153、ILE150和PHE332残基形成疏水相互作用。

考虑到PSMD14作为去泛素化酶的既定作用及其与LDHA的 documented相互作用，研究人员假设PSMD14可能参与调节LDHA的翻译后调控。

2.4 PSMD14调节LDHA蛋白稳定性

为了评估去泛素化酶PSMD14对LDHA蛋白稳定性的影响，研究人员使用Western blotting和qRT-PCR测量了PSMD14敲低或过表达后胰腺癌细胞中的LDHA蛋白水平和mRNA水平。结果显示，在敲低胰腺癌细胞系或PSMD14过表达细胞中，LDHA转录水平没有显著变化，但LDHA蛋白水平相应增加或减少。

值得注意的是，尽管基于细胞的实验表明PSMD14不影响LDHA转录，但TCGA数据库分析显示，在胰腺癌组织中它们的mRNA水平呈显著正相关。组织和细胞水平之间表达的差异可能与胰腺癌特有的复杂肿瘤微环境有关。未来的研究可以整合单细胞测序来进一步阐明该微环境中不同细胞亚群内的特定调控网络。

蛋白质稳定性研究表明，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后，LDHA蛋白表达以时间依赖性方式增加。进一步的实验证明，随着PSMD14表达的增加，LDHA蛋白表达逐渐增加。在用蛋白质合成抑制剂CHX处理的胰腺癌细胞中，当共同施用MG132时，LDHA蛋白的半衰期延长。

为了进一步研究LDHA的降解途径，研究人员使用蛋白酶体抑制剂MG132抑制泛素-蛋白酶体降解途径。有趣的是，在MG132处理的胰腺癌细胞中，PSMD14表达的变化并未显著改变LDHA水平。此外，MG132消除了PSMD14敲低引起的LDHA蛋白水平下降，而氯喹（一种自噬-溶酶体抑制剂）在相同条件下对LDHA水平没有影响。这些结果表明PSMD14通过泛素-蛋白酶体途径而不是自噬-溶酶体途径调节LDHA。

在CHX处理的胰腺癌细胞系中，PSMD14过表达延长了外源性LDHA蛋白的半衰期，而PSMD14敲低缩短了外源性LDHA蛋白的半衰期。这些发现共同支持了PSMD14介导LDHA降解的观点。

2.5 PSMD14去泛素化LDHA

由于PSMD14是一种去泛素化酶，研究人员研究了其去泛素化LDHA的潜力。泛素化分析显示，在PSMD14过表达的胰腺癌细胞中，LDHA泛素化水平降低，而在PSMD14敲低的胰腺癌细胞中，LDHA泛素化水平增加。

鉴于先前的研究强调了thiolutin对PSMD14的详细抑制作用，研究人员进一步评估了其对LDHA去泛素化的影响。Western blot结果证实，PSMD14的药理抑制增加了LDHA泛素化水平。此外，基于结构域的泛素化分析表明，PSMD14的MPN结构域和UBD都是LDHA去泛素化所必需的。

用带有不同泛素链的HA-Ub质粒转染HEK-293T细胞显示，PSMD14有效去除了LDHA上的K48和K63连接的泛素链，揭示了PSMD14稳定LDHA蛋白的机制。总之，PSMD14被鉴定为一种特异性去泛素化酶，可去泛素化并稳定LDHA。

2.6 PSMD14通过LDHA驱动的乳酸积累和组蛋白乳酸化促进PC细胞脂质沉积

在糖酵解途径中，LDHA通过催化丙酮酸转化为乳酸发挥重要作用。乳酸历史上被认为是糖酵解的废物。然而，最近的研究表明，乳酸在肿瘤微环境中的Warburg效应期间大量产生，并且可以触发组蛋白赖氨酸乳酸化，这是一种新的表观遗传修饰，可以直接从染色质刺激基因复制。

为了研究PSMD14是否影响胰腺癌细胞中的乳酸水平并随后介导组蛋白乳酸化，研究人员首先测量了PSMD14过表达和PSMD14敲低胰腺癌细胞中的乳酸水平。结果证明PSMD14过表达增加了乳酸水平，而PSMD14敲低降低了乳酸水平。然而，PSMD14过表达诱导的乳酸水平增加被糖酵解抑制剂oxamate和LDHA敲低显著抵消。总之，这些发现支持PSMD14通过LDHA增加胰腺癌细胞中乳酸积累的观点。

升高的乳酸水平可以修饰组蛋白上的赖氨酸残基，导致乳酸化。最近，组蛋白乳酸化被报道调节各种生物学过程，包括癌细胞的肿瘤发生、进展、免疫逃避和代谢重编程。

研究人员首先检测了胰腺癌细胞中的总蛋白乳酸化水平和几个已知的组蛋白乳酸化位点。只有H3K18la在PSMD14过表达后显示显著升高，这使研究人员专注于H3K18la在胰腺癌中的作用。随后的实验证明，PSMD14介导的H3K18la增加可以通过LDHA敲低和oxamate处理逆转，表明这种修饰是乳酸依赖性的调节。

值得注意的是，糖酵解抑制剂剂量依赖性地降低了胰腺癌细胞中的H3K18la水平。在糖酵解抑制下，外源性葡萄糖补充未能增加组蛋白乳酸化水平，而单独用乳酸处理有效地恢复了这些修饰。

考虑到乳酸在胰腺癌中的显著上调，研究乳酸诱导的H3K18la修饰如何调节胰腺癌细胞的脂质生物合成至关重要。此外，LDHA的靶向抑制和oxamate减少了PSMD14过表达诱导的脂质积累，并抑制了细胞的增殖能力。总之，研究结果表明PSMD14介导的脂质沉积与其调节组蛋白乳酸化有关。然而，这种关系的精确分子机制仍有待阐明。

2.7 组蛋白乳酸化激活PC中ACLY基因转录

组蛋白乳酸化是一种新的表观遗传修饰，据报道可以直接从染色质调节基因转录。为了进一步阐明H3K18la在基因表达中的调控功能，研究人员使用抗H3K18la抗体在胰腺癌细胞中进行了染色质免疫沉淀（ChIP-seq），以发现受H3K18la调控的基因靶点。

结果显示，H3K18la修饰主要富集在转录起始位点（TSS）附近，这是转录调控的关键区域。通过整合ChIP-seq、RNA-seq、TCGA数据库的数据和脂质代谢相关基因集，研究人员确定了五个差异表达基因。

ACLY是调节脂质代谢的关键基因，可能通过调节代谢和脂质合成来影响胰腺癌的恶性进展。使用 integrative genomics viewer（IGV）基因组浏览器可视化ChIP-seq结果，发现在ACLY基因内有一个H3K18la修饰的结合位点（peak_2929），位于启动子下游约+9546至+12945 bp处。

ACLY表达与TCGA数据集中乳酸产生相关基因呈显著正相关。研究人员进一步设计了针对该结合位点的引物并进行ChIP-qPCR。结果显示，与IgG相比，H3K18la在peak_2929处显著富集。此外，Nala的应用显著增加了H3K18la在peak_2929处的富集，而糖酵解抑制剂或EP300 siRNA减少了这种富集。因此，该位点可能是H3K18la修饰ACLY的关键位点。

值得注意的是，peak_2929并不位于ACLY的经典启动子区域（+99至-2000 bp）。先前的研究表明，H3K18la可以在增强子区域调节基因转录。研究人员假设PSMD14介导的H3K18la可能通过调节其增强子活性来促进ACLY转录。

首先，研究人员检查了增强子标记H3K27ac、H3K4me1和H3K4me2在胰腺癌细胞peak_2929处的富集。结果显示这些标记在peak_2929处显著富集，表明该位点靠近ACLY基因增强子。

为了阐明H3K18la的调控机制，研究人员将含有minp启动子 alone或minp启动子加H3K18la peak_2929增强子位点的pGL4.23质粒转染到乳酸钠诱导的细胞和对照细胞中。双荧光素酶报告基因检测显示，乳酸钠诱导增加了ACLY增强子活性。然而，在缺乏H3K18la peak_2929位点的质粒中未检测到这种效应。

为了精确识别H3K18la的主要结合区域，研究人员构建了含有不同结合片段（fragments）的pGL4.23报告质粒。用20 mM Nala处理后，观察到pGL4.23_peak_2929_WT的荧光素酶活性显著增加。与其他片段相比，H3K18la在突变构建体pGL4.23_peak_2929_mut #2和pGL4.23_peak_2929_mut #5中表现出更强的结合活性。

随后，研究人员使用ATAC-seq分析了表达野生型ACLY（WT）和突变体（#2和#5，MUT）的PANC-1细胞中的染色质可及性。结果显示，在ACLY MUT组中，TSS周围的测序read分布显著减少。进一步分析显示，位于启动子-TSS区域的差异可及性峰的比例在MUT组（33.56%）明显低于WT组（47.15%），并且开放染色质区域的总体密度显著降低。在5372个鉴定出的差异峰中，4366个在MUT组中信号减少。此外，基因组浏览器轨迹分析进一步证实，在突变体中，启动子区域附近的read计数显著减少。这些结果表明，在ACLY突变（#2和#5）后，H3K18la在该区域的富集减少，导致ACLY启动子区域的染色质可及性降低，从而抑制了ACLY基因的转录表达。

值得注意的是，Nala应用后ACLY mRNA水平增加，糖酵解抑制剂处理后降低，并且通过Nala补充部分恢复。在