GmPM30编码区T/C非同义多态性通过GmLEA1-GmPM30-GmLEC1模块增强大豆耐盐性及产量的机制与育种应用

本研究鉴定出大豆晚期胚胎发生丰富（LEA）基因GmPM30的一个关键T/C非同义多态性（SNP213），该变异通过增强GmLEA1-GmPM30-GmLEC1模块互作强度，显著提升大豆耐盐性（150 mM NaCl）及产量（百粒重与单株粒重）。RNA-seq揭示HapT单倍型激活更广泛的应激通路，进化分析表明该模块在大豆驯化中受人工选择且适应高纬度盐碱地区。研究开发了KASP分子标记（Kasp-HSY）用于标记辅助选择（MAS）育种，田间试验证实聚合优良等位基因（GmLEA1-Hap3-GmPM30-HapT-GmLEC1-Hap3）可显著提高盐碱地大豆产量，为作物抗逆育种提供了可复制范例。

　　

2.1 GmPM30的分子特征与表达模式

系统进化分析表明GmPM30与苜蓿Group 3 LEA蛋白Medtr4g011230同源，该蛋白类群以在脱水条件下稳定膜结构、结合离子著称。逆转录定量PCR（RT-qPCR）显示GmPM30转录水平在NaCl、H₂O₂和脱落酸（ABA）处理下显著上升，其中ABA诱导呈持续上升趋势，而NaCl和H₂O₂处理呈现先升后降模式。当使用ABA生物合成抑制剂氟啶酮（FLU）或NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘（DPI）共处理时，盐诱导的GmPM30表达被完全抑制，表明其表达依赖ABA和H₂O₂信号通路。组织特异性表达分析发现GmPM30在萌发期根中高表达，且在种子发育后期表达急剧增加，符合LEA蛋白晚期胚胎发育富集的特性。亚细胞定位实验通过绿色荧光蛋白（GFP）融合表达证实GmPM30定位于细胞核与内质网（ER），与核标记P2300及内质网标记mScarlet-HDEL共定位。

2.2 GmPM30正向调控大豆耐盐性

通过大豆发根转化体系构建GmPM30过表达（OE）与RNA干扰（RNAi）株系。150 mM NaCl处理下，GmPM30-OE株系叶片更大、鲜重与干重更高，而RNAi株系表型相反。生理指标检测显示OE株系在盐胁迫下具有更高的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及光系统II光化学效率（Fv/Fm），丙二醛（MDA）含量降低约25%。稳定转基因大豆T₂代株系（OE-1、OE-2）在盐胁迫下同样表现出增强的生长性能与生物量积累，证实GmPM30通过稳定细胞膜、减少氧化损伤提升耐盐性。

2.3 GmPM30自然变异的驯化选择与地理适应

Tajima's D、核苷酸多样性及F_ST分析表明GmPM30在大豆驯化中经历选择清除。对555份大豆种质进行单倍型分析鉴定出6种主要单倍型，其中Hap2仅存在于栽培种，Hap5为野生种特有。编码区SNP213（T/C）导致第72位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸（T72A），定义两大单倍型：HapT（含Hap1、Hap2）和HapC（含Hap3–6）。频率分析显示HapT在现代育种中被正向选择，而HapC在栽培种中逐渐淘汰。地理分布上，HapC在盐胁迫较弱的南方地区富集（26.6%），而HapT在盐碱胁迫严重的黄淮（81.7%）与北方（87.0%）高纬度地区显著富集。

2.4 HapT与HapC的功能分化验证

田间表型鉴定表明，携带HapT的种质在山东潍坊与东营盐碱地（土壤可溶性盐0.3 g/100 g干土）中百粒重与单株粒重均显著高于HapC种质。萌发实验显示盐胁迫6天后HapT种质发芽率更高，幼苗期生物量也显著增加。转基因实验表明，在表达量无显著差异前提下，HapT-OE株系比HapC-OE株系在盐胁迫下具有更高鲜重与干重。RNAi与CRISPR/Cas9敲除GmPM30-HapT的发根体系则表现出更强的盐敏感性，证实HapT为优良等位基因。

2.5 GmPM30与GmLEA1、GmLEC1的互作机制

酵母双杂交（Y2H）筛选发现GmPM30与GmLEA1（一种未知功能的LEA同源蛋白）及GmLEC1（含豆科凝集素结构域）互作。双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）及荧光素酶互补成像（LCI）实验在体内外验证了互作真实性。关键的是，GmPM30-^Thr（HapT编码蛋白）与GmLEA1/GmLEC1的互作强度显著高于GmPM30-^Ala（HapC编码蛋白）。AlphaFold3结构预测显示HapT互作时分子间距离仅为HapC的1/2–1/3，且蛋白构象改变。盐胁迫下，共表达GmPM30与GmLEA1或GmLEC1的本氏烟叶片离子泄漏、MDA及H₂O₂积累显著降低，表明互作具有协同保护效应。此外，盐处理12小时后GmPM30-^Thr蛋白丰度显著高于GmPM30-^Ala，且其稳定性依赖与GmLEA1/GmLEC1的互作。

2.6 GmLEA1与GmLEC1的驯化选择与育种潜力

群体遗传分析表明GmLEA1与GmLEC1同样经历驯化选择。GmLEA1存在5种单倍型，其中Hap3为优良单倍型，在改良品种中频率较低（15.63%），但盐胁迫下产量性状突出。GmLEC1有4种单倍型，Hap3频率从野生种到栽培种逐步增加，但在改良品种中仍仅占21.82%，具备高育种价值。

2.7 单倍型特异性转录组响应

RNA-seq分析发现盐胁迫下HapT-OE发根差异表达基因（DEGs）数量（5875个）显著少于EV（8073个）与HapC-OE（7894个），表明HapT赋予更稳定的转录组响应。KEGG富集显示HapT特异激活苯丙烷生物合成、类黄酮合成等通路，GO分析发现“血红素结合”“四吡咯结合”“过氧化氢分解过程”等氧化应激相关条目富集。热图分析证实HapT-OE中ROS生成（GmRbohB-2）、离子转运（GmCHX19、GmNHX2）及氧化应激响应（GmPOD1、GmPER64）基因显著上调。

2.8 优良单倍型聚合提升盐碱地产量

候选基因关联分析鉴定出GmPM30、GmLEA1、GmLEC1中与产量性状显著相关的SNP。聚合优良单倍型（GmPM30-HapT+GmLEA1-Hap3+GmLEC1-Hap3）的组VIII在盐胁迫下单株粒重（26.43 g）与百粒重（21.00 g）均最高，且包含骨干品种中黄13（ZH13）。等位基因频率显示GmPM30-HapT在栽培种中已高频率利用，而GmLEA1-Hap3与GmLEC1-Hap3在改良品种中频率低，未来聚合潜力巨大。

2.9 GmPM30-HapT的育种应用

开发了KASP标记Kasp-HSY用于基因分型，准确率100%。以携带HapT的骨干品种黑豆12为亲本构建F₃群体，盐碱地（东营）田间试验表明HapT系比HapC系出苗率、生物量及产量均显著提升，单株粒重提高约20%，证实GmPM30-HapT的育种价值。

3 讨论与展望

本研究揭示了GmPM30编码区非同义SNP通过调节蛋白互作强度影响耐盐性的新机制，提出了GmLEA1-GmPM30-GmLEC1模块协同增强膜稳定性与氧化应激响应的模型。该模块的驯化选择与地理适应特征为大豆抗逆育种提供了进化理论基础，KASP标记与单倍型聚合策略为分子设计育种提供了实用工具，推动由单一基因向多基因网络育种的范式转变。