靶向降解TERRA lncRNA的RNA G-四链体RIBOTAC技术在ALT癌症治疗中的突破与应用

本刊推荐：本研究首次利用RIBOTAC（核糖核酸酶靶向嵌合体）技术开发出可特异性降解TERRA（端粒重复序列RNA）的小分子降解剂。该化合物选择性结合TERRA的G-四链体（G4）结构，招募RNase L诱导其降解，在HeLa和U2OS细胞（ALT癌症模型）中有效破坏端粒功能并抑制克隆形成，为ALT驱动型癌症提供了新型靶向治疗策略。

　　

1 引言

长链非编码RNA（lncRNAs）是长度超过200个核苷酸且不具备蛋白编码能力的转录本，已成为基因组稳定性、表观遗传编程和RNA加工的关键调控因子。这些转录本通过调节基因表达、转录因子或RNA结合蛋白，影响多种细胞过程和疾病通路。与蛋白质不同，其功能常编码于高级RNA结构中，使其能够动态地与染色质修饰因子、转录因子和RNA结合蛋白相互作用。在癌症中，lncRNA失调几乎涉及所有癌症特征，包括无限增殖、基因组不稳定性和治疗抵抗。尽管具有关键生物学作用，但由于使用小分子选择性靶向结构RNA存在固有挑战，lncRNA在很大程度上仍未成为药物靶点。

TERRA（端粒重复序列RNA）是一种独特且尚未完全理解的lncRNA，由RNA聚合酶II从染色体末端的亚端粒启动子转录而来，由5′-UUAGGG-3′重复长序列组成，长度从数百到数千个重复不等，例如在7p、13q、15q和20q染色体上发现的那些。TERRA表现出动态结构，范围从包含连续G-四链体（G4）的高度结构化区域到与端粒DNA稳定杂交形成R环并有助于其在端粒调控功能的片段。在健康细胞中，TERRA有助于端粒监视和复制时序。相反，在替代性端粒延长（ALT）癌细胞中，其依赖同源重组而非端端酶，TERRA显著上调，有助于ALT相关PML体（APBs）的组装。

结构重复性、密集功能拓扑结构以及在ALT端粒维持中的关键作用的结合，使得TERRA不仅具有生物学吸引力，而且成为选择性治疗干预的高度引人注目的靶点。尽管其结构明确且相互作用，TERRA在很大程度上仍未得到充分探索，其生物学作用尚未完全了解。其复杂且稳定的3D构象对精确靶向提出了重大挑战，特别是通过反义寡核苷酸。这种结构源于富含鸟嘌呤的序列，这些序列形成G4-四链螺旋基序，通过堆叠鸟嘌呤四分体之间的Hoogsteen氢键和协调的一价阳离子（尤其是钾离子（K⁺））稳定。

为了研究TERRA的作用，我们旨在开发能够选择性降低ALT癌细胞系中其丰度的分子。为了靶向降解这种独特结构的lncRNA，我们采用了RIBOTAC（核糖核酸酶靶向嵌合体）技术，该技术将RNA结合小分子与RNase L的招募剂连接起来，RNase L是一种被小分子激活的内切核糖核酸酶，可诱导其二聚化和酶激活。RNase L优先在位于未配对区域的UN基序（其中N代表任何核糖核苷酸）处切割RNA。值得注意的是，（UUAGGG）n重复架构在G4平面之间提供了高密度的UN基序，当通过RIBOTAC分子拉近时，将TERRA定位为RNase L的理想底物。

我们的RIBOTAC设计包括两个组件：1）基于ISCH的G4结合支架，ISCH是一种对RNA G4结构具有荧光开启特性小分子；2）共价连接的RNase L招募模块，该模块参与RNase L活性位点以在三元复合物形成时触发位点特异性RNA切割。虽然G4也存在于致癌转录本如NRAS、KRAS、FGF2、ADAM10和BCL2中，并激发了开发G4结合小分子的努力，但区分疾病相关与生理性G4仍然具有挑战性。因此，我们专注于lncRNA TERRA，其重复的G4平面和密集的UN基序间距共同为RIBOTAC设计提供了实用的选择性处理手段。

2 结果与讨论

使用先前报道的ISCH支架设计并合成了一系列能够选择性降解形成G4的长链非编码RNA TERRA的RIBOTACs，ISCH是一种选择性结合G4 DNA和RNA结构的小分子。我们的策略集中于通过铜（I）催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）将ISCH与两种化学上不同的RNase L招募剂进行模块化组装。该设计使我们能够探索招募剂身份和连接体组成对RNase L招募和TERRA降解的影响。ISCH核心被修饰以通过保留其G4结合能力的合成路线包含末端炔烃。

为了评估与RNase L招募剂的结合是否影响ISCH支架的G4结合能力，我们首先评估了新合成的RIBOTACs响应各种核酸结构的固有荧光特性。通过将浓度递增的RNA TERRA添加到固定浓度的每种化合物（ISCH、RIBO-ISCH-1至RIBO-ISCH-4）中进行荧光滴定，然后进行光谱扫描以监测发射强度变化。正如预期，所有化合物在单独缓冲液中表现出最小荧光，与游离配体的低发射特性一致。然而，添加RNA或DNA G4结构，特别是RNA TERRA、DNA TERRA和RNA MT3，引发了显著的荧光开启响应，最大发射中心≈660 nm。相反，缺乏G4潜力的对照序列（antiTERRA和TERRAmut）产生可忽略的变化，支持相互作用的结构特异性。

为了直接测量结合亲和力和选择性，我们用几种核酸结构滴定RIBO-ISCH-1：RNA TERRA、RNA MT3、DNA TERRA、TERRAmut（非G4 RNA）和anti-TERRA（非G4 DNA）。RIBO-ISCH-1对TERRA G4 RNA表现出最强的结合亲和力（K_d = 1.2 μM）。相比之下，其对MT3 RNA G4和DNA TERRA G4的亲和力较弱（K_d = 20.5和17.5 μM respectively），并且与非G4对照没有可测量的结合。这些结果表明，RIBO-ISCH-1对TERRA RNA G4具有显著的选择性，与其他G4或非G4结构相比，对RNA TERRA的亲和力大约高一个数量级。

为了确认荧光激活依赖于G4折叠，在G4解折叠条件（含硫酸铜的缓冲液）下进行了平行实验。在此条件下，先前激活荧光的RNA序列未能诱导任何信号增强，相反，发射强度降至背景水平，强调了折叠的G4构象对于生产性结合的要求。这些发现表明RIBOTACs保留了ISCH支架的G4选择性结合和荧光开启行为，并对核酸靶标的构象状态敏感响应。为了量化结合亲和力，通过将每种化合物滴定到FAM标记的RNA TERRA溶液中并监测相应的荧光变化来确定EC₅₀值。有趣的是，结合时观察到FAM信号的浓度依赖性减弱。这种减少表明配体与荧光团标记的RNA G4之间存在近距离相互作用。所得的EC₅₀值表明微摩尔结合亲和力：RIBO-ISCH-1为4.090 μM，RIBO-ISCH-2为4.166 μM，RIBO-ISCH-3为8.675 μM，RIBO-ISCH-4为9.279 μM。

为了评估RIBOTAC结合是否促进RNase L介导的RNA降解，我们使用预折叠的RNA TERRA与每种化合物孵育，然后加入RNase L进行时间分辨荧光测定。荧光强度的降低被用作RNA降解的读数，因为切割事件破坏了RNA-RIBOTAC相互作用。RNA在含钾缓冲液中预折叠以促进G4形成，并与固定浓度的每种RIBOTAC孵育。加入RNase L后，观察到时间依赖性的荧光降低。与仅缓冲液对照相比，RIBO-ISCH-1和RIBO-ISCH-2在存在RNase L的情况下表现出显著降低的荧光信号，表明有效招募了RNase L并随后发生了RNA切割。相反，RIBO-ISCH-3和RIBO-ISCH-4在RNase L处理样品和对照样品之间没有显示显著差异，表明这些变体在测试条件下不促进RNase L活性。这些结果表明，包含第一个招募剂的RIBOTACs（RIBO-ISCH-1和RIBO-ISCH-2）能够指导RNase L切割含有G4的TERRA RNA，而用于RIBO-ISCH-3和RIBO-ISCH-4的第二个招募剂未能引起切割，强调了招募剂身份在决定RIBOTAC活性中的重要性。为了评估背景RNase L活性是否可以解释荧光损失，我们进行了一个对照，其中预折叠的TERRA与母体ISCH结合剂复合，然后暴露于RNase L。荧光适度下降（两个半小时内约20%），这可以通过近距离诱导的淬灭或RNase L背景切割活性来解释。相比之下，RIBO-ISCH-1和RIBO-ISCH-2在同一时期分别产生了显著的约50%和约60%的下降，表明招募剂依赖性地参与了RNase L和RNA降解。

在观察到RIBO-ISCH-1和RIBO-ISCH-2在体外促进RNase L介导的TERRA切割后，我们接下来在细胞环境中评估它们的活性。为此，我们选择了HeLa细胞，尽管它是端粒酶阳性而非ALT，但表现出高TERRA丰度，使我们能够测试RIBO-ISCH-1/2活性是否与ALT无关且可推广到不同癌症细胞类型。用ISCH、RIBO-ISCH-1或RIBO-ISCH-2处理细胞，同时使用两个RNA靶向对照：TERRA特异性反义寡核苷酸（ASO）和乱序ASO对照（Scr）。使用位点特异性引物通过RT-qPCR定量TERRA-7p水平。单独使用ISCH处理并未改变TERRA水平，证实结合本身不会导致RNA降解。有趣的是，在双功能化合物中，只有RIBO-ISCH-1诱导了TERRA-7p丰度的显著减少，而RIBO-ISCH-2尽管在体外证明了RNase L招募，但没有效果。值得注意的是，用RIBO-ISCH-1观察到的降解程度与阳性对照ASO达到的程度相当，并且两者都与非靶向Scr明显不同。这些数据强调了生产性RNase L招募和细胞相容性对于实现有效RIBOTAC介导的RNA敲低的要求。为了进一步表征TERRA降解的时间动态，我们用RIBO-ISCH-1进行了时间过程实验，并在处理后6、12、24和48小时监测了TERRA-7p、TERRA-13q和TERRA-20q水平。虽然早在24小时就观察到显著减少，但在48小时观察到多个TERRA位点存在统计学显著且时间依赖性的TERRA丰度下降，并达到最大敲低。这种逐渐下降表明细胞RIBOTAC活性随时间积累，并可能反映了RNase L招募和内源性RNA转换机制的综合效应。我们接下来对多个TERRA位点的RIBO-ISCH-1进行了剂量反应分析。在HeLa细胞中，RIBO-ISCH-1在7p、20q和13q位点诱导了清晰、剂量依赖性的TERRA转录本减少。从10 nM浓度开始观察到统计学显著的敲低，在100 nM时效果最大。有趣的是，在1 μM时观察到增加，可能是由于钩状效应，这是杂交分子靶向降解中的已知机制。

相反，单独使用ISCH处理并未导致TERRA表达的显著变化，强化了仅结合不足以降解且需要酶招募的观点。

RIBO-ISCH-1的效果与ASO相当，突出了这种非序列基于降解剂在靶向结构化lncRNAs方面的实用性。为了确定RIBO-ISCH-1在ALT阳性细胞中是否保留活性，我们在U2OS细胞中进行了相同的剂量反应实验，这些细胞由于其端粒酶非依赖性端粒维持机制而表现出升高的TERRA表达。正如预期，RIBO-ISCH-1在TERRA-7p、13q、20q和15q位点减少了转录本丰度，呈剂量依赖性 manner。再次，100 nM是最有效的剂量，用ISCH处理未观察到减少。这些结果表明RIBO-ISCH-1在ALT细胞独特的染色质环境中保持活性，展示了跨癌症亚型的广泛适用性。

为了评估RIBO-ISCH-1对TERRA与一般rG4靶向的选择性，我们查询了G4RNA数据库（Scott lab）并保留了具有rG4形成实验证据（“True”）的条目；然后通过QGRS Mapper评分对候选者进行排名，并选择顶部集合进行RT-qPCR。该面板包括NRAS、KRAS、FGF2、BCL2、ADAM10、MT3、VEGFA、APC、ACVR1C、CCND3、CTNNB1、CTSB、GRIA1、HIRA、IGF2和THRA。用100 nM RIBO-ISCH-1处理48小时，在U2OS和HeLa细胞中选择性降低了TERRA水平，而不影响其他测试的含G4转录本的表达。相反，在细胞中对TERRA无活性的RIBO-ISCH-2，引起了非TERRA G4 RNA如NRAS、FGF2、ADAM10和BCL2的适度减少，表明其招募模块可能有利于替代的RNA结构或构象，两种化合物之间细胞活性的差异强调了连接体架构的关键作用：RIBO-ISCH-1中灵活、亲水的PEG连接体可能有利于与RNase L形成三元复合物的最佳空间定位，而RIBO-ISCH-2中刚性的脂肪族连接体可能阻碍生产性接合。正如预期，在任一细胞系中，使用相同浓度100 nM的ISCH对任何评估的转录本（包括TERRA）没有显著影响。这些发现表明RIBO-ISCH-1对TERRA高度选择性超过其他G4 RNA，可能是由于TERRA中存在的重复G4结构独特。这种选择性降解突出了RIBO-ISCH-1作为靶向TERRA相关病理中TERRA的化学探针的实用性。总之，这些数据证实RIBO-ISCH-1作为一种有效的RIBOTAC，能够在端粒酶阳性和ALT阳性癌细胞中诱导内源性TERRA的降解。该活性既是时间又是浓度依赖性的，在多个基因组位点稳健，并且在效力上与序列特异性反义寡核苷酸相当。

我们接下来评估观察到的TERRA降解是否依赖于RNase L酶活性。用靶向RNase L的siRNA（siRNase L）、非靶向乱序对照（Scr）预处理细胞或不做处理，然后用RIBO-ISCH-1处理。RT-qPCR分析显示，沉默RNase L消除了TERRA敲低效应，证实降解是RNase L依赖性的。为了验证RNase L沉默的效率和特异性，我们通过RT-qPCR和western blot在mRNA水平确认了敲低。为了确保siRNA处理不会非特异性地影响其他基因转录本，我们还测量了siRNase L转染后无关的含G4基因的表达。在这些对照转录本中没有观察到显著变化，表明RNase L耗竭不影响TERRA丰度。在单独的机制评估中，我们检查了RIBO-ISCH-2是否也通过RNase L操作。使用FGF2作为代表性转录本，我们发现siRNase L预处理减弱了RIBO-ISCH-2诱导的FGF2敲低，表明该化合物也需要RNase L活性来介导RNA降解。这些发现强烈支持RIBOTAC机制依赖于RNase L酶活性进行靶向RNA切割，而不是脱靶效应或转录抑制的结果。为了确定RIBO-ISCH-1及其母体支架ISCH是否在细胞中结合相同的RNA结合位点，我们进行了一个竞争测定，其中细胞用浓度递增的ISCH预处理，然后用固定浓度的RIBO-ISCH-1处理。RT-qPCR分析显示，ISCH预处理以剂量依赖性方式减弱了RIBO-ISCH-1的RNA降解活性，在较高ISCH浓度下导致TERRA水平部分或完全恢复。这些结果表明ISCH与RIBO-ISCH-1竞争结合TERRA，表明两种分子识别G4结构内相同或重叠的结合口袋。这种功能性竞争突出了RIBOTAC对其结构化RNA靶标特异性，并确认有效降解需要通过G4结合模块直接靶标接合。

下一步是确认细胞内RIBO-ISCH-1的荧光是否源自细胞中RNA或DNA的接合。我们进行了核酸酶敏感性测定；用RIBO-ISCH-1处理的U2OS细胞暴露于DNase I或RNase A，并记录荧光变化。RNase A显著降低了荧光信号，而DNase I相对于单独RIBO-ISCH-1没有显著影响，表明细胞信号主要反映与RNA G4的结合而不是DNA G4。在这种特异性确立后，我们接下来评估了RIBO-ISCH-1是否影响基因组DNA完整性。我们在U2OS细胞中使用基于γH2AX的流式细胞术评估了DNA损伤。γH2AX是DNA双链断裂的既定标志物，增加的荧光强度与DNA损伤的存在相关。这个实验特别重要，因为RIBO-ISCH-1结合G4结构，这些结构存在于RNA和DNA中；因此，确定其活性是否扩展到基因组DNA至关重要。重要的是，在任何处理组中，包括RIBO-ISCH-1、ISCH或阳性对照，均未观察到γH2AX荧光强度的显著偏移。ASO也促进TERRA耗竭，被包括作为阳性对照以确保检测到与TERRA耗竭相关的任何DNA损伤。观察到RIBO-ISCH-1和ASO的可比结果加强了降低TERRA水平不会引发DNA损伤反应的结论。直方图叠加进一步证实了可检测的DNA损伤反应的缺失，表明RIBO-ISCH-1尽管具有结合G4结构的能力，但不会诱导全局DNA切割。这些发现表明该化合物表现出RNA选择性，因为TERRA被靶向降解而形成G4的DNA不受影响。为了检查TERRA耗竭是否改变ALT相关同源重组（HR）通路，我们通过Western blot测量了处理48小时的U2OS细胞中RAD51和FANCD2的水平。RAD51是介导链入侵并有助于ALT端粒HR（例如T-SCE和断裂诱导的端粒合成）的中心重组酶，而FANCD2是Fanconi贫血通路效应子，响应复制应激并定位于APBs以协调ALT细胞中的端粒修复。相对于未处理细胞或对照组，用RIBO-ISCH-1（100 nM）或ISCH（100 nM）处理后蛋白质丰度未改变。与缺乏γH2AX诱导一起，这些发现表明RIBO-ISCH-1不会触发广泛的DNA修复激活，支持选择性、RNA导向的机制（TERRA靶向）而不是直接DNA接合。

我们接下来检查了RIBO-ISCH-1对ALT阳性癌细胞标志的影响，包括ALT相关PML体的存在和形成集落的能力。APBs是由PML蛋白与端粒DNA和重组蛋白共定位形成的核焦点，被认为是ALT活性的定义特征。U2OS细胞中的免疫荧光染色显示，用RIBO-ISCH-1处理后APBs数量减少了50%，而ISCH没有可测量的影响。APBs的量化证实了这种减少，表明TERRA耗竭破坏了APBs的形成或稳定性。为了确定这种效应是否特定于ALT细胞，我们还在HeLa细胞中进行了免疫荧光染色，显示RIBO-ISCH-1处理后PML体数量类似减少，表明该效应不限于ALT阳性背景。

最后，为了确定RIBO-ISCH-1是否影响ALT细胞的长期增殖能力，我们进行了集落形成测定。用RIBO-ISCH-1处理的U2OS细胞与未处理或ISCH处理的对照相比，形成显著更少和更小的集落，量化显示在21天实验中克隆形成潜力明显下降。这种表型与选择性TERRA降解后ALT介导的端粒维持受损一致。我们接下来评估了RIBO-ISCH-1是否影响增殖速率，并在10 μM观察到适度但统计学显著的减少。为了确定这种增殖和集落形成的减少是否由凋亡引起，我们检查了caspase-3激活。仅在多柔比星阳性对照中检测到切割的caspase-3，在未处理、ISCH处理、RIBO-ISCH-1处理、ASO处理或乱序对照样品中没有信号。因此，受损的集落形成可能源于非凋亡、缓慢作用的机制， centered on TERRA targeting，而不是凋亡细胞死亡。

总之，这些发现表明，虽然RIBO-ISCH-1不诱导DNA损伤，但它破坏了ALT表型的关键特征，即PML体的形成和维持集落生长的能力，支持TERRA在维持ALT活性和细胞增殖中的功能作用。

3 结论

总之，我们开发了一种RIBOTAC降解剂，它通过利用结合G4特异性和招募RNase L的双功能方法，选择性切割lncRNA TERRA的G4部分。虽然母体化合物识别RNA和DNA G4结构，但其转化为RIBOTAC重新编程其活性 exclusively toward RNA，导致选择性降解TERRA而不影响基因组DNA。在该系列中，RIBO-ISCH-1 emerged as a potent and selective degrader，可有效降低端粒酶阳性和ALT阳性癌细胞中多个染色体位点的TERRA水平。值得注意的是，尽管对TERRA具有微摩尔结合亲和力，RIBO-ISCH-1在纳摩尔浓度下诱导降解，强调了RNase L招募的催化性质。这种放大突出了RIBOTAC设计的力量，其中单个结合事件可以触发多个切割事件，通过酶周转增强效力。这种选择性是由TERRA中独特富集的重复G4基序驱动的，能够实现精确接合和RNase L介导的切割。 resulting degradation suppresses ALT-associated phenotypes such as APB formation and clonogenic growth。与先前描述的反义策略不同，这种基于小分子的方法允许活性和结构-功能关系的模块化调节。重要的是，RIBO-ISCH-1不相关的含G4 RNA，突出了其作为精确工具解析TERRA生物学的实用性。 Beyond its immediate impact，该技术能够开发新的化学工具来研究仍然 largely unexplored roles of TERRA，并为靶向ALT驱动癌症提出了有前景的治疗策略。尽管我们的功能读数集中于ALT，TERRA也在端粒酶阳性癌症和正常组织中调节端粒生物学。因为TERRA既抑制端粒酶又支持端粒R-loop稳态，其降解预计是 context-dependent：适度减少可能减轻端粒R-loop驱动的复制应激，而 deeper depletion could de-repress telomerase。因此，在端粒酶阳性肿瘤中的部署需要调整剂量和靶向递送。这些考虑拓宽了我们方法 beyond ALT 的相关性，同时承认对正常端粒维持的潜在责任。

4 实验部分

细胞培养：HeLa细胞（AC-free, ECACC 08011102）从欧洲认证细胞培养物收藏中心获得，并在含有Earle's盐和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS; Sigma-Aldrich, F9665）和1%青霉素/链霉素溶液（Diagnovum, D910）。U2OS细胞（ATCC HTB-96）从美国类型培养物收藏馆购买，并在含有L-谷氨酰胺的McCoy's 5A培养基中维持，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS; Sigma-Aldrich, F9665）和1%青霉素/链霉素溶液（Diagnovum, D910）。两种细胞系在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中培养，并在使用前确认无支原体。

荧光研究：通过监测荧光强度变化评估合成化合物对G-四链体形成RNA（RNA TERRA、DNA TERRA和MT3）相对于非G4对照（anti-TERRA和TERRA-mutant）的结合选择性。简言之，将浓度递增的RNA或DNA序列滴定到固定浓度的化合物中，置于1×折叠缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 和100 mM KCl）中。滴定前，通过加热至95°C 5分钟并逐渐冷却至室温折叠核酸。使用Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader（BioTek, Agilent）进行荧光测量，并分析荧光变化以评估每种化合物的相对结合偏好。

通过监测荧光强度随化合物浓度的变化，测量合成化合物与5'–FAM–标记的TERRA RNA相互作用的半数最大有效浓度（EC₅₀）。简言之，将RNA在1×折叠缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 和100 mM KCl）中通过95°C加热5分钟，然后缓慢冷却至室温进行折叠。化合物溶液在同一缓冲液中制备。将化合物滴定到固定浓度的RNA（1 μM）中，从20 μM开始并连续稀释（1:2）至7.32 nM，总共24个浓度。使用Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader（BioTek, Agilent）测量化合物浓度与荧光变化的曲线图确定EC₅₀值。

对于核酸酶敏感性测定，将细胞接种在96孔板中，在约90%汇合度时，用4%（w/v）多聚甲醛在PBS中室温固定，用冷PBS洗涤×3次，并用0.2% Triton X-100在37°C透化30分钟。洗涤后，将细胞与DNase I或RNase A（200 U mL^?1 in PBS）孵育3小时或不做处理，然后加入RIBO-ISCH-1（20 μM）。使用Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader（BioTek, Agilent）在2.5小时内收集动力学荧光读数，使用荧光团的适当激发/发射设置，并计算相对于添加前基线的荧光变化（ΔF）。

为确定结合亲和力（Kd），将RNA TERRA、DNA TERRA、RNA MT3、TERRA-mutant或anti-T