卟啉修饰碳纳米移液管瞬态伏安法揭示单活细胞内活性氮物种的动态相互转化

本综述系统介绍了利用卟啉修饰碳纳米移液管（TMPyP-CNP）通过瞬态伏安法实现单细胞水平活性氮物种（RNS）的精准检测与动态转化过程研究。该技术突破了传统稳态电化学方法的局限，首次在活细胞内揭示了NO2?氧化通过NO2中间体的化学-电化学-化学（CEC）反应机制，为细胞信号传导和氧化应激研究提供了强有力的原位分析平台。

　　

引言

活性氮物种（RNS）包括一氧化氮（NO）及其氧化衍生物（如NO₂、NO₂^?和ONOO^?）在细胞信号传导和氧化应激中起着至关重要的作用。它们参与免疫防御和血管舒张过程，一旦失调就会导致细胞损伤、癌症和神经退行性疾病。由于RNS在活细胞中具有动态性、反应性强和丰度低的特点，其准确检测和定量面临重大挑战。例如，一氧化氮（NO）因其半衰期短（<10秒）、浓度低（亚微摩尔级）以及易与活性氧物种反应并与亚硝酸盐（NO₂^?）和二氧化氮（NO₂）相互转化而难以监测。

目前检测RNS物种的技术包括荧光、发光、比色、电子顺磁共振和高效液相色谱等。其中，基于超微电极和纳米电极的电化学方法具有操作简便、原位非侵入性检测以及在单细胞水平高时空分辨率等优势。然而，纳米电极通常仅限于稳态电化学研究，其缺点在于只有一个特征时间（r₀²/D，r₀为电极半径，D为扩散系数）。除非电位扫描速率极高（如>10⁷ V s^?1），否则感兴趣的反应瞬态特性（如RNS之间的相互转化或溶液中的耦合反应）很难通过纳米电极的循环伏安图揭示。

导电纳米移液管（CNPs）因其内部具有大的电活性界面，为单活细胞中的瞬态伏安研究提供了新机遇。纳米尺寸的尖端可实现非侵入性插入细胞，而内部大空腔通过改变扫描速率（v）可实现时间尺度可调的薄层电化学。通过优化电位扫描速率，可以解析瞬态特征或耦合化学反应。此外，大的内表面也可通过修饰实现对特定分析物的检测，以揭示单活细胞中的复杂反应。

结果与讨论

碳纳米移液管（CNP）通过化学气相沉积法制备，然后通过静电吸附在5,10,15,20-四(4-吡啶基)-21H,23H-卟啉（TMPyP）溶液中浸泡约5分钟，在其内表面修饰TMPyP，形成TMPyP-CNP。透射电子显微镜（TEM）图像显示TMPyP-CNP保持了CNP的开放移液管几何形状。相应的EDS图谱揭示了碳和氮元素在纳米移液管内的均匀分布，证实了卟啉的成功修饰。

通过电化学测试评估TMPyP修饰过程。在0.1 M KCl和1 mM K₄Fe(CN)₆中以0.1 V s^?1进行循环伏安（CV）测试，CNP和TMPyP-CNP均显示出对称的薄层电化学响应峰，源自移液管内[Fe(CN)₆]^3?/4?的氧化/还原。TMPyP-CNP的较小峰值电流表明TMPyP的修饰，因为其导电性低于碳。随着修饰时间的增加，峰值电流持续降低。约20分钟后，碳表面几乎完全被覆盖，获得几乎为零的电流。通过数值模拟拟合峰值电流可粗略评估修饰效率。基于简单的扩散模型，约40%的碳表面被TMPyP覆盖。

使用制备的TMPyP-CNP研究对氮物种的传感性能。在1 mM NaNO₂和10 mM PBS中，TMPyP-CNP在约+0.76 V处显示出比CNP大得多的氧化电流。较高NaNO₂浓度下增加的峰值电流证实了该峰源自亚硝酸盐氧化。获得了各种浓度下峰值电流的线性校准曲线。根据拟合斜率，TMPyP-CNP的灵敏度（3.44 nA mM^?1）比CNP（0.05 nA mM^?1）高约70倍。这种增加源于带正电的TMPyP吸引NO₂^?离子并催化亚硝酸盐氧化。总体而言，与先前报道的传感器相比，TMPyP-CNP显示出宽检测范围和低检测限。

除了NO₂^?，NO也是一种重要的RNS，具有复杂的反应途径。令人兴奋的是，TMPyP-CNP对NO也表现出优异的传感性能，显示出两个强且分离良好的氧化峰。第一个峰在+0.56 V，表明NO氧化成NO₂^?，而第二个氧化峰在+0.76 V，与NO₂^?的氧化峰紧密匹配，表明NO₂^?进一步氧化成NO₃^?。因此，TMPyP-CNP可以在CV中有效区分NO和NO₂^?物种。此外，制备的电极还显示出良好的稳定性，在50次连续CV扫描后仅约4.2%的信号降解，以及优异的选择性，因为NaNO₃、NaCl、多巴胺（DA）和尿酸（UA）的存在不影响NaNO₂的电流信号。最重要的是，TMPyP-CNP对H₂O₂无响应，这在单细胞分析中可大大消除H₂O₂的干扰。

由于RNS易于快速相互转化，还通过改变扫描速率（v）研究了NO₂^?氧化动力学。非常有趣的是，峰值电流在较宽的扫描速率范围内出现平台，表明可能存在化学反应控制过程。同时，当v > 0.15 V s^?1时，约+0.7 V处逐渐增加的还原峰开始叠加，表明不稳定的中间体被还原。相比之下，在CNP上，氧化峰值电流随v线性增加，且未观察到还原峰。为确认瞬态特征，进行了常规脉冲伏安法（NPV）测试。在氧化扫描中，亚硝酸盐氧化峰在CNP和TMPyP-CNP上均清晰显示，而仅在TMPyP-CNP的还原扫描期间约+0.7 V处存在明确定义的肩峰，表明TMPyP可以稳定中间体以进行后续还原过程。

由于卟啉可以通过NO₂中间体有效催化NO₂^?氧化成NO₃^?，还原峰被认为来自NO₂还原。在这种情况下，NO₂^?首先被氧化成NO₂，然后要么与H₂O反应形成NO₂^?和NO₃^?，要么进行电化学还原成NO₂^?，这取决于时间尺度或v。在高v下，NO₂没有足够时间与H₂O完全反应，因此在其反向扫描中观察到还原峰；而在低v下，所有NO₂均已与H₂O反应，不会产生还原峰。总体而言，提出了TMPyP-CNP上亚硝酸盐氧化的CEC反应机制（*代表TMPyP中的活性位点）：

NO₂^? + * → *NO₂ + e^?

*NO₂ + H₂O → * + NO₃^? + 2H⁺

*NO₂ + e^? + 2H⁺ → * + NO + H₂O

利用提出的CEC机制，在TMPyP-CNP中进行了数值模拟，并获得了类似的CV响应。有趣的是，各种v下的氧化和还原峰值电流都可以与CEC模型很好地拟合，从而可以提取动力学。平台电流表明表面吸附是速率决定步骤，拟合速率为0.1 s^?1。同时，估计吸附的NO₂寿命约为2.67秒，远长于典型的亚毫秒级自由基寿命。接下来，进行了密度泛函理论（DFT）计算以更好地理解TMPyP上的催化亚硝酸盐氧化过程。计算表明，NO₂^?在TMPyP活性位点上的吸附是一个放热过程，自由能变化为-0.77 eV。此外，在TMPyP上形成NO₃^?的计算自由能（-3.11 eV）甚至更负。综上所述，DFT结果突出了TMPyP中的β-碳作为活性位点，负责其卓越的电催化氧化NO₂^?性能。

然后将TMPyP-CNP插入单个活HeLa细胞中以测量细胞内RNS。结果显示在约+0.7 V处产生一个宽的氧化峰，表明氮物种的氧化，很可能是NO和NO₂^?。为了进一步确认该氧化峰的来源，通过添加10 μM H₂O₂或维生素C调节细胞内RNS水平，分别诱导升高和降低的细胞内RNS浓度。总结了氧化中包围的积分电荷，并计算了相应的RNS浓度。正如预期，与未处理的HeLa细胞相比，在H₂O₂处理后3和5小时，RNS浓度分别从26增加到56和79 μM。相反，当添加0.1 μM VC时，细胞内RNS浓度显著降低至几乎为零，证明了维生素C在氧化应激后降低RNS水平的有效性。请注意，TMPyP-CNP对H₂O₂无响应，这可以大大排除细胞中ROS的贡献。然后，还通过改变v研究了细胞中RNS氧化动力学。在还原扫描中显示出相同的+0.72 V处的还原峰，归因于NO₂还原。值得指出的是，由于电极和细胞的异质性，有时这种NO₂还原峰在CV中不明显，而NPV总是可以在细胞中捕获这种NO₂信号。

为了进一步揭示活细胞内必要的RNS相互转化途径，我们用给定试剂刺激细胞。已知细胞色素c（Cc）通过消除NO₂^?刺激活细胞产生NO，而硝普钠（SNP）是一种产生NO的典型药物。正如预期，在用10 μM Cc孵育细胞后，在0.6 V处显示出明显的NO氧化峰，并在0.72 V处降低的NO₂^?氧化峰。100 μM的更高Cc浓度会进一步加剧NO峰并降低NO₂^?峰。不同的是，当细胞用SNP孵育1小时时，观察到增强的NO产生，并保留了NO₂^?氧化峰。这些结果表明，TMPyP-CNP可以通过简单的伏安研究有效检测NO、NO₂^?及其在单个活细胞内的动态相互转化。监测RNS快速变化的能力突出了TMPyP-CNP在研究动态NO相关细胞过程方面的潜力。

结论

总之，通过利用卟啉修饰碳纳米移液管（TMPyP-CNP）内的薄层电化学，我们在单个活细胞中应用瞬态伏安研究，揭示了细胞内RNS之间的动态相互转化过程。TMPyP-CNP对NO和NO₂^?以及中间体NO₂在溶液和单个活细胞中均显示出非常好的传感能力。然后提出了通过NO₂中间体进行NO₂^?氧化的CEC机制，以很好地解释有趣平台氧化峰和高扫描速率下的瞬态还原峰。此外，TMPyP-CNP提供细胞内RNS浓度和动态相互转化的实时监测，从而为细胞氧化还原过程提供了新的见解。这项工作通过建立一个强大的纳米电极平台来研究瞬态生物反应，超越了传统的稳态方法，对理解基础氧化还原生物学和开发新型生物传感应用具有重要意义。

致谢

非常感谢国家自然科学基金（22374150）和中央高校基本科研业务费对本工作的支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。