大西洋海杆菌脂质提取物的表征及其作为高性能生物润滑剂（Biolubricant）的应用潜力

本综述系统探讨了从大西洋海杆菌（Marinobacter atlanticus）中提取的脂质作为可再生生物润滑剂的潜力。研究通过高分辨率质谱（HRMS）鉴定其主要成分为棕榈酸棕榈油酸酯（palmityl palmitoleate），并利用差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）揭示了其0°C玻璃化转变、40°C熔融及220°C起始降解的热稳定性。摩擦学测试表明，该提取物在纯态及与聚α烯烃（PAO）低比例（<5 wt.%）混合时表现出优异的摩擦系数（μ≈0.117）和磨损率（K≈10-7 mm3/N·m），性能优于传统植物油，为工业润滑剂配方提供了可持续替代方案。

　　

1 引言

生物润滑剂的研究可追溯至列奥纳多·达·芬奇的早期见解，而古代地中海工程师已使用水、石膏和动物脂肪的组合来促进建筑、提升战车轮性能并增强盾牌效果，其历史可追溯至公元前第二或第三千年。如今，润滑剂几乎应用于每个行业，覆盖多种工况条件。由于大多数现有润滑剂源自石油，它们面临供应链脆弱性和价格波动性的问题。一种潜在的替代方案是利用生物过程生产类似传统润滑剂的分子。此外，开发工具以设计、控制和规模化生物过程及材料生产，为合成和实施先前无法用于工业的材料（即生物优势材料）开辟了可能性。

目前，生物润滑剂主要源自植物油，包括油菜籽、大豆、蓖麻和棕榈等众多替代品。尽管替代和生物友好来源的列表不断增长，但生物润滑剂的使用率仍然较低，仅占润滑剂总市场份额的约2%。虽然生物润滑剂常因氧化稳定性差、低倾点导致的低温性能差以及水解敏感性而受限，但其高闪点、一致粘度、较低排放、可生物降解性和循环经济潜力等特性，使其优于传统润滑剂。生物润滑剂化学多样性高，包括甘油三酯、脂肪酸和酯等组分，可通过酯化和环氧化等技术进行改性，以增强粘度和抗氧化性等性能。然而，生物润滑剂在与石油衍生润滑剂直接竞争时仍面临挑战，包括较高的生产成本和与来源变异性相关的性能不一致性。未来的发展旨在提高生物润滑剂的经济性，并可能在某些特定应用中超越传统选项。总体而言，该领域正在迅速发展，以满足环境可持续性和性能需求。

生物润滑剂的一个新兴来源是微生物，特别是使用藻类作为脂质来源。利用光合微生物生产润滑剂作为石油和合成来源的替代品具有优势，因为其培养不需要耕地，不同于植物替代品，且其代谢循环 inherently 捕获碳。几种菌株如小球藻（Chlorella sp.）、栅藻（Scenedesmus sp.）、杜氏藻（Dunaliella sp.）、葡萄藻（Botryococcus sp.）、Coelastrella sp. 和红藻（Porphyridium sp.）已被研究用于脂质生产，几乎全部用于生物燃料。不幸的是，藻类培养需要磷和氨基肥料，这些几乎完全来自不可再生来源。此外，许多微藻菌株的光合生长需要复杂且具有挑战性的工艺设计，以实现规模化过程，由于光在光生物反应器中的穿透有限。这种物理限制导致基于藻类的过程在规模化时面临设计挑战，因为需要高表面积与体积比以提供足够的光照给藻类。这些缺点因此限制了使用微藻进行脂质生产的经济和生态效益。

一个较少探索的潜在生物衍生脂质来源是通过原核生物。许多这些微生物在细胞质中产生脂质包含体，包含多种脂质类别，包括脂肪酸、聚（3-羟基丁酸酯），以及更罕见的三酰甘油（TAG）和蜡酯（WE）。微生物，如海洋细菌物种Marinobacter，能够自然积累来自非糖类原料（如有机酸和烷烃）的脂质，以响应环境压力如氮限制。该生物在全球海洋中无处不在，并被表征为机会营养菌，促进其在各种环境条件下的生存，范围从地热喷口和北极条件到石油田盐水。大西洋海杆菌（Marinobacter atlanticus）是一种好氧、异养海洋细菌，于2015年从美国新泽西州塔克顿罗格斯海洋野外站的海水收集中分离、富集和测序。M. atlanticus产生的主要脂质产品是蜡酯，一种由脂肪酸和脂肪醇酯组成的中性脂质。这些细菌蜡酯通常具有链长范围从C₂₈到C₃₆，具有不同长度和饱和度的脂肪酸和脂肪醇组分。这些分子在响应营养限制（如氮缺乏）时产生，对多种应用至关重要，包括润滑剂、化妆品、药品和纺织添加剂。然而，这些由M. atlanticus产生的脂质材料尚未被表征，其摩擦学性能也未被评估。

本文探讨了使用M. atlanticus作为生物衍生脂质的潜在来源，用于生物润滑剂。我们的工作展示了从该细菌中提取的脂质的生成和表征，并揭示了其作为润滑剂的潜力。提取物通过高分辨率质谱（HRMS）、差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TGA）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱进行表征。提取物作为直接从提取的润滑剂产品，以其纯态形式测试，并作为两种工业常见合成基础油（聚α烯烃（PAO）和多元醇酯（POE））的添加剂进行测试。我们的结果表明，提取的生物润滑剂在摩擦系数和磨损率方面优于基准。此外，我们讨论了这些生物润滑剂需要改进的领域，以制成可行的商业产品。这些结果揭示了从Marinobacter spp.提取的生物材料的化学和材料特性，并首次展示了该物种直接从提取的脂质作为生物润滑剂的潜在来源。

2 材料与方法

2.1 培养和脂质提取方法

2.1.1 菌株培养和培养基

M. atlanticus从冷冻库存划线到由BB培养基制成的平板上，每升（L）：18.75克（g）海洋肉汤，5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母提取物，5 g NaCl和15 g琼脂。平板在30°C下培养3天。过夜（起始）培养物从3天旧的平板接种到50 mL聚丙烯离心管中，含有20 mL低钙人工海水培养基与26 mM琥珀酸钠。低钙人工海水（ASW）培养基制备如下，每升：27.5 g NaCl，3.8 g MgCl₂·6H₂O，6.78 g MgSO₄·7H₂O，0.72 g KCl，0.62 g NaHCO₃，0.066 g CaCl₂·2H₂O，1 g NH₄Cl，0.05 g K₂HPO₄和1 mL Wolfe's微量矿物溶液。灭菌后，培养基通过无菌过滤的CO₂鼓泡，直到pH达到6.6至6.8之间。这里使用的典型ASW培养基的变体包括低钙（0.066 g/L CaCl₂·2H₂O；以支持浮游生长），低氮（0.1 g/L NH₄Cl；以促进脂质生产），以及添加26 mM琥珀酸钠作为碳源。起始培养物在30°C培养箱中过夜生长，摇动230 rpm。

2.1.2 脂质生产的生长实验

脂质生产实验在2-L玻璃锥形瓶中进行，含有1 L低氮、低钙ASW与26 mM琥珀酸作为碳源。每个瓶接种10 mL来自过夜（起始）培养物的培养物。瓶置于30°C培养箱中，摇动230 rpm 100小时。

2.1.3 从M. atlanticus提取脂质

生长100小时后，收获培养物进行脂质提取。细胞通过离心30分钟在4°C和10,000 × g下沉淀，弃去上清液。所得细胞沉淀在-80°C下储存至少24小时，然后冷冻干燥，记录冷冻干燥细胞沉淀重量，并在-20°C下储存，直到用己烷提取。对于脂质提取，冷冻干燥细胞沉淀在化学通风橱中转移到15-mL玻璃离心管中，带有特氟龙衬里螺旋盖，先前用乙醇洗涤和冲洗，然后干燥。为确保所有细胞沉淀已从离心瓶中移除，使用1 mL己烷快速冲洗瓶子，然后倒入玻璃离心管中。重复第二次，导致每个15-mL玻璃离心管中含有细胞沉淀的2 mL己烷。细胞沉淀使用不锈钢刮匙研磨并与提取溶剂混合。接下来，每个15-mL玻璃离心管浸入超声水浴中三次，每次10秒。每个管然后涡旋高速度10秒。15-mL玻璃离心管的盖子在可能由于挥发性溶剂产生压力的情况下通风。接下来，玻璃离心管在2000 × g下离心2分钟。离心后，己烷层使用1-mL玻璃注射器小心转移至20-mL闪烁瓶中，不扰动细胞沉淀。另加2 mL己烷到每个15-mL玻璃离心管中，细胞沉淀机械破坏，管再次超声、涡旋和离心。在2 mL己烷转移至20-mL闪烁瓶后，此过程通过添加最终2 mL己烷重复第三次。协议结束时，20-mL闪烁瓶中含有约6 mL己烷。接下来，使用带有冷阱的离心蒸发器蒸发掉己烷。20-mL闪烁瓶的剩余内容是粗蜡产品。20-mL闪烁瓶在添加己烷前和蒸发己烷后称重，以给出粗蜡重量的估计（毫克）。

2.2 化学表征

2.2.1 质谱

气相色谱/质谱（GC/MS）级n-己烷（≥98%纯度）从Sigma-Ald购买。蜡酯，棕榈酸棕榈油酸酯（>99%纯度）和油酸棕榈油酸酯（>99%纯度）从Alfa Chemistry获得。在己烷中创建浓缩溶液以生成标准品。高分辨率质谱（HRMS）测量使用Thermo Orbitrap Exploris 480质谱仪完成，配备大气压化学电离（APCI）源，用于正离子模式。

为了提供HRMS分析，约1.0 mg脂质材料溶解在5 mL n-己烷中。储备溶液进一步用相同溶剂稀释20倍。稀释的脂质混合物直接注入APCI源，流速10.0 μL/min，使用500 μL Hamilton注射器和Chemyx注射泵。应用正离子放电电流2.0 μA，APCI蒸发器和离子转移管温度分别设置为250°C和320°C。为了维持稳定喷雾，使用N₂气体作为鞘气、辅助气和清扫气，任意单位分别为8、5和1。轨道阱的分辨率设置为480,000。对于参考蜡酯化合物的测量，使用上述相同程序，除了储备溶液在直接注入APCI源前通过系列稀释稀释100倍。对于MS¹测量，质量范围220–600 Da中相对丰度>1%的离子使用Thermo Xcalibur软件处理。软件提供检测离子的m/z值、元素组成、环和双键当量值（RDB）和质量精度（ppm单位）。

为了促进结构阐明/鉴定，对来自细菌提取物的几个离子和已知电离化合物进行碰撞活化解离（CAD）。然后将所得的CAD光谱相互比较。为了完成CAD测量，感兴趣的离子以0.4 Da的质量窗口隔离，并在35%至45%的能量下进行CAD。

2.2.2 热分析和光谱

热分析使用差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）进行。对于DSC，约15 mg细菌提取物加载到标准铝盘中，空盘用作参考。样品在-20°C下平衡5分钟，然后以每分钟5°的速率从-20°C加热到300°C。相变温度通过吸热峰分析确定。对于TGA，约15 mg细菌提取物加载到铂坩埚中，并在氧化条件下从室温以每分钟10°C的加热速率加热到600°C。降解起始点确定为发生1%质量损失的温度。

细菌提取物的衰减全反射傅里叶变换红外（FTIR-ATR）光谱使用钻石砧（Pike MIRacle）、MCT（HgCdTe）液氮冷却检测器获取，分辨率为4 cm，Happ-Genzel变迹，并平均64次扫描。应用ATR校正到数据。纯提取物的可见波长拉曼光谱使用785 nm二极管激光激发、1200线/cm光栅和长工作距离50×物镜进行。

2.3 润滑剂评估

2.3.1 摩擦和磨损

润滑剂样品使用纯细菌提取物以其原始形式生成，并以1%、5%和10%的重量百分比与工业标准合成基础油POE（Calumet Calester A）和PAO（RB Products Inc., PAO 4 cSt）组合。提取物和基础油分别加热到60°C，并在各自的重量百分比组合下组合，然后轻轻摇动以确保混合。使用PAO和POE的纯样品比较提取物作为添加剂的性能。

使用1/8英寸52100钢球（60 HRC Grainger）在5 N负载下以200 rpm滑动 against 25 mm抛光钢表面（Anton Paar, 90MnCrV8, 62 HRC, Ra < 0.05 μm），使用针盘摩擦计（Anton Paar TRB³）跨越300 m。在此配置中，最大赫兹接触压力约为1.7 GPa。滑动前，钢盘通过乙醇和异丙醇清洁准备，然后在氮气流下干燥。每种润滑剂类型使用单个钢盘。样品通过加热盘和润滑剂到60°C准备，然后约15 μL预热润滑剂移液到盘上，并使用清洁金属刮匙均匀涂抹表面。润滑剂和盘在60°C下保持5分钟以允许均匀分布，然后冷却到室温并滑动。对于每种润滑剂和盘组合，滑动半径变化以避免滑动 against 相同区域，使用7、7.75和8.5 mm滑动半径。这种可变半径转化为每个半径约150、160和180 mm/s的滑动速度。完成三次运行后，钢盘储存在干燥器中以限制摩擦膜的变化。摩擦数据从摩擦计导出，并使用Matlab解析。

球对应体的磨损在滑动后通过光学显微镜成像评估，并测量磨损疤痕直径。磨损体积使用球冠几何计算，比磨损率K使用以下方程计算：K = V / (N × d)，其中V是磨损体积，N是施加的法向负载，d是总滑动距离。

3 结果与讨论

多批M. atlanticus被培养、提取并组合用于化学表征和润滑剂评估。批次运行包括四个2-L瓶，每个含有1 L培养物，并行操作。每个瓶接种M. atlanticus的过夜培养物并孵育100小时，平均产生0.196 ± 0.059 g/L干细胞重量（DCW），蜡酯滴度为0.025 ± 0.05 g/L培养物，蜡酯产量（细胞含量）为0.14 ± 0.05 g/g DCW。这里观察到的平均蜡酯滴度类似于先前从M. atlanticus培养物在浮游状态或作为生物膜在固定床反应器中生长的观察，并且在蜡酯生产细菌观察到的滴度范围（0.01–0.17 g/L）内。这里观察到的产量比报道的Marinobacter aquaeolei VT8高4倍，也称为Marinobacter hydrocarbonoclasticus或Marinobacter nauticus，以及其他蜡酯积累物种，如Acinetobacter baylyi ADP1。重要的是，Lenneman等人也声明他们通常获得约10%含量的蜡酯由M. aquaeolei VT8生产，尽管没有提供支持此声明的数据。然而，10%的蜡酯产量在从M. atlanticus获得的产量误差范围内。这里报道的滴度和产量都大于类似海洋、烃降解细菌的观察：Alcanivorax borkumensis、Alcanivorax jadensis和M. nauticus。这些结果为M. atlanticus中的脂质生产提供了基线，以确定需要优化以最大化脂质滴度、速率和产量的条件。

通过直接注入APCI源耦合到Orbitrap质谱仪完成稀释细菌提取物的MS¹测量。因此，没有使用色谱，由于Orbitrap的分辨率（480,000 FWHM）不需要分离。观察MS¹光谱，来自提取物的离子有两个明显区域，范围在约m/z 229–285和m/z 423–517的m/z值。第一区域由具有14–18碳和环和双键当量（RDB）值0.5的酯代表。这一发现表明第一区域中的离子不含烯烃功能。分析第二区域，离子由含有28–35碳的结构代表。与第一区域不同，第二区域中的离子以范围从0.5到4.5的RDB为特征。这一发现表明酯可能包含 up to four 烯烃功能。无论两个明显区域，检测到的离子含有两个氧原子，并且主要由具有偶数碳数的结构代表。

MS¹测量也在已知酯化合物棕榈酸棕榈油酸酯和油酸棕榈油酸酯上完成。从MS¹测量，棕榈酸棕榈油酸酯和油酸棕榈油酸酯 exhibited 质子化 [M+H]⁺ 作为主要电离机制。来自稀释细菌提取物的离子也 demonstrated 质子化作为主导电离机制。结果支持酯功能的存在对于组成此提取物的化合物。MS²测量也在已知化合物上完成，并与来自提取物的未知离子比较以促进鉴定和结构阐明。比较质子化棕榈酸棕榈油酸酯和细菌提取物离子m/z 479 [C₃₂H₆₂O₂+H]⁺的MS²光谱，光谱看起来几乎相同。结果支持未知酯离子m/z 479 likely 是质子化棕榈酸棕榈油酸酯。此外，当油酸棕榈油酸酯和未知离子m/z 505 [C₃₂H₆₂O₂+H]⁺的MS²光谱相互比较时，光谱也看起来几乎相同。在来自未知离子m/z 505的MS²光谱中，碎片离子m/z 83、97、245和263的相对丰度的轻微差异可能表明存在具有 [C₃₂H₆₂O₂+H]⁺ 元素组成的结构异构体。

离子m/z 229、257和285也进行CAD。显著地，在MS²光谱中检测到的碎片离子观察到显著重叠。这可能暗示酯分子的类似结构特征，如烷基链长度。

总体而言，MS结果支持提取物含有不同碳数的酯功能，存在（RDB ≥ 1.5）或不存在（RDB 0.5）烯烃功能。使用负离子模式电喷雾电离表明化合物 likely 不由脂肪酸代表，因为未检测到具有对应于羧基功能的元素组成的阴离子。尽管物种以高置信度鉴定，结构对润滑剂性能有重要意义，因为它们可能受羰基位置以及顺式构象碳双键存在的影响。

细菌提取物的代表性FTIR光谱显示标记峰位置，表1呈现细菌提取物光谱的带和区域分配。参考光谱对于两种基础油可以在支持信息中看到。2800和3000 cm之间的带与脂肪烃的CH₂伸缩一致，其他强峰与CH₂振动模式在722、1357和1466 cm找到。与C═O和C─O部分一致的带在1738 cm找到，识别为ν(C═O)伸缩，ν(C─O)伸缩在1170 cm。此峰侧面是弱峰在1115和1242 cm， likely 与C─O─C对称和不对称伸缩相关。进一步弱峰在581 likely 与C─O面外变形相关。总之，光谱特征与具有酯键的脂质一致，支持MS¹和MS²，并与先前报告一致。纯细菌提取物的微拉曼光谱与此解释一致，显示与脂肪烯烃与酯化学一致的带。

细菌提取物的材料性能使用DSC和TGA评估。纯提取物的DSC分析显示吸热熔融峰 near 40°C，玻璃化转变在0°C，和结晶峰在-30°C。TGA显示细菌提取物稳定 up to just above 200°C， where 它开始降解， noted 降解温度220°C。如此高降解温度与生物润滑剂一致，提供有效的广泛适用用例对于此材料。这些数据提供提取物应用作为润滑剂的功能范围；然而，熔融温度产生利基纯态应用潜力由于室温以上流动点。

细菌提取物的摩擦系数μ和对应体磨损率K测量为平均μ = 0.117(± 0.02)和K = 1.2 × 10^-7(± 0.5 × 10^-7) mm³/N·m。摩擦系数与由于半径变化的滑动速度变化没有相关性。磨损轨道显示通过光学轮廓测定法可测量的磨损小。磨损轨道显示来自犁削磨损的轻评分标记，并且总体，纹理具有 above and below 抛光样品表面的区域。轨道 discolored 带有棕色色调与氧化铁一致。轨道的拉曼显微镜显示在许多区域与Fe₂O₃一致的带，但润滑剂没有其他变化。原始细菌提取物在摩擦或磨损方面没有 outright outperform 纯工业基础油；然而，性能与其他生物润滑剂和蜡酯相比有利。绝对比较这些润滑剂具有挑战性由于实验条件和材料选择的差异。比较PAO+1%的摩擦和磨损结果揭示组合提取物的承诺，因为摩擦系数保持低，并且磨损性能比PAO alone 提高 nearly 23%。此外，添加提取物到POE基础油保留低磨损率，并结合POE+5%摩擦系数的减少，表明细菌提取物作为添加剂到PAO和POE的潜在使用。作为参考，边界 regime 润滑剂可以实现摩擦系数和比磨损率 near μ = 0.10和K = 10^-7 mm³/N·m may 被分类为有效润滑剂。超越这些摩擦系数和磨损率的减少在边界润滑 regime 系统通常源于添加剂如二硫化钼、二硫代磷酸锌、特定纳米粒子组合或特定涂层，如类金刚石涂层。

与原始基础油相比，细菌提取物摩擦学性能的潜在限制可能是其在室温下的玻璃态。纯PAO和POE在室温下保持液体，允许润滑剂回流到磨损疤痕，而细菌提取物在室温下保持玻璃态，无法回流到磨损疤痕。当混合细菌提取物与PAO和POE，提取物在低重量百分比浓度下与PAO溶解良好，但在任何浓度下不溶于POE。PAO溶解度主要由与提取物的非极性相互作用控制，描述为蜡酯，不产生足够极性以禁止低浓度部分溶解。在较高浓度，见于PAO+10重量百分比提取物，润滑剂混合物有明显的浑浊，表明在该浓度下溶解度差。然而，POE和蜡酯不结合良好，因为在这种混合物中极性和分子间相互作用差异太大，POE相对极性而蜡酯主要非极性。这些差异导致在室温条件下混合不良和相分离，并且见于所有POE和细菌提取物混合物表现出浑浊和提取物岛屿形成在较高重量百分比浓度。最后，酯键本身是否可访问以产生与金属表面的反应膜， say 以形成羧酸，暴露 during 滑动，仍然未知。这可能与氧化润滑剂如酯可能，但可能需要比本研究更高温度用于活化。

4 结论

总之，脂质从M. atlanticus的批次培养物中提取，表征，并显示为可行生物润滑剂。质谱鉴定棕榈酸棕榈油酸酯作为脂质提取物的主要组成化学物种。红外光谱支持此测量，并为摩擦膜形成的未来光谱研究提供基础。热分析鉴定降解温度 near 220°C，和玻璃化转变和熔融温度分别为0°C和40°C。润滑剂性能揭示纯细菌提取物在室温下可接受的摩擦系数和磨损率—μ = 0.117和K = 1.2 × 10^-7 mm³/N·m。然而，提取物在测试期间没有很好地回流到磨损路径，因此限制其直接从提取的润滑剂性能在25°C。超过细菌提取物熔融温度的温度调查需要进一步表征润滑剂性能，因为摩擦膜形成 likely suppressed 没有润滑剂回流。此外，细菌提取物溶解到工业基础油PAO和POE，提取物重量百分比添加到PAO below 10% 改善整体性能与良好溶解度。作为生物润滑剂的应用被识别，基础润滑剂与应用特定添加剂的配方可能帮助改善材料的性能。此外，微生物脂质生产的进一步优化必要以产生更多材料用于测试并移动过程向规模化和商业可行性。