低浓度苯并(a)芘通过GRP75介导的线粒体-内质网偶联异常诱发胆管反应及木犀草素的靶向干预机制

本刊推荐：为探究环境毒素苯并(a)芘(B[a]P)诱发肝胆疾病的机制，研究团队通过体内外模型发现B[a]P通过表观遗传调控促使GRP75过表达，导致内质网-线粒体偶联异常、Ca2+超载和ROS过度生成，进而激活EMT过程促使胆管细胞纤维化表型转化。研究创新性发现中药单体木犀草素可通过靶向GRP75逆转上述病理过程，为环境相关性肝胆疾病防治提供了新靶点。

　　

在环境污染与健康风险日益受到关注的今天，长期暴露于低浓度环境污染物对肝胆疾病的影响已成为重大公共卫生问题。苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, B[a]P)作为多环芳烃类化合物的典型代表，被国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物，主要通过有机物质不完全燃烧产生并存在于工业排放和食品加工过程中。虽然既往研究证实B[a]P对肝细胞具有显著毒性，但其对胆管系统特别是异常胆管反应(Abnormal Ductular Reaction, DR)的影响机制尚不明确。异常DR作为胆管增生性疾病的共同病理特征，是肝纤维化、肝硬化甚至胆管癌(CCA)发展的重要推动因素，阐明其形成机制对防治肝胆疾病具有重要意义。

针对这一科学问题，南京医科大学杜鑫茹、高延成等研究人员在《Cell Death and Disease》发表了最新研究成果，系统揭示了低浓度B[a]P通过葡萄糖调节蛋白75(GRP75)介导的细胞器交互失调诱发胆管反应的分子机制，并创新性地发现传统中药单体木犀草素(Luteolin)的靶向干预价值。

本研究综合运用体内动物模型、原代细胞培养、分子对接技术和表观遗传学分析方法。通过建立C57BL/6J小鼠长期B[a]P暴露模型（12.5 mg/kg灌胃4周），结合3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可力丁(DDC)阳性对照模型，采用组织病理学染色(H&E、Masson、Sirius Red)、免疫组化(IHC)和血清生化检测评估肝损伤程度。体外实验分离原代胆管细胞(BECs)和采用SG231胆管癌细胞系，通过慢病毒转染构建基因敲低模型，利用透射电镜(TEM)观察细胞器超微结构，采用荧光探针技术检测线粒体钙离子和活性氧(ROS)水平，结合蛋白质免疫印迹(Western blot)和实时定量PCR(qRT-PCR)分析分子表达变化。药物筛选通过中医药整合药理学数据库(TCMIP)挖掘潜在活性成分，采用生物层干涉技术(BLI)验证分子互作关系。

建立低浓度B[a]P诱导的硬化性胆管炎样病变模型

研究发现，经过4周B[a]P暴露后，小鼠血清ALT、AST、GGT和ALP水平显著升高，肝组织病理显示门静脉区出现不规则胆管增生伴炎性细胞浸润，CK19和αSMA染色证实反应性胆管显著增生，Masson和Sirius Red染色显示明显胶原沉积和"洋葱皮样"改变。原代BECs经100 nM B[a]P长期处理（6个培养周期）后，αSMA表达和胶原分泌显著增加，其条件培养基能明显激活肝星状细胞(LX-2)。这些结果表明低浓度B[a]P长期暴露可导致异常DR，并通过旁分泌作用协同促进硬化性胆管炎样病理病变的发展。

低剂量B[a]P通过DNA去甲基化表观遗传激活GRP75

研究人员发现B[a]P长期暴露显著升高细胞和小鼠模型中GRP75的表达水平。基于TCGA数据库分析显示，GRP75基因在肝癌中突变频率极低，但其mRNA水平与启动子甲基化程度呈负相关。表观遗传学分析表明，B[a]P处理导致GRP75启动子区DNA甲基化水平逐渐降低，而甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)处理可显著抑制B[a]P诱导的GRP75表达上调。免疫组化和免疫荧光证实B[a]P暴露后肝细胞和胆管细胞中GRP75蛋白表达均显著升高。

B[a]P通过GRP75引起异常ER-线粒体偶联、线粒体Ca²⁺超载、ROS过量产生和EMT

GRP75作为线粒体相关内质网膜(MAM)的关键桥接蛋白，其异常表达导致内质网-线粒体偶联异常。透射电镜显示B[a]P处理的BECs细胞器接触距离显著缩短。钙成像技术证实线粒体Ca²⁺浓度显著增加而内质网Ca²⁺相对减少，ROS水平明显升高。上皮-间质转化(EMT)标志物分析显示波形蛋白(Vimentin)表达增加而E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达降低。通过GRP75敲低实验发现，抑制GRP75表达可逆转B[a]P引起的细胞器偶联异常、钙超载、ROS过量产生和EMT过程，并显著降低胆管细胞的胶原分泌和肝星状细胞激活能力。

靶向GRP75的中药单体化合物筛选

通过Coremine、HERB和SymMap数据库挖掘，发现丹参和火麻仁对硬化性胆管炎具有治疗作用。TCMSP数据库分析和分子对接模拟显示，木犀草素是这两种草药中唯一能与GRP75有效相互作用的有效成分。生物层干涉实验证实木犀草素与重组GRP75蛋白有效结合，并可通过泛素-蛋白酶体途径促进GRP75蛋白降解。

木犀草素抑制B[a]P诱导的异常DR

体外实验表明，木犀草素处理显著改善B[a]P引起的ER-线粒体接触距离缩短，减少Ca²⁺从ER向线粒体的流入，降低ROS水平，抑制EMT过程以及αSMA和胶原蛋白的表达和分泌。从B[a]P和木犀草素共同处理细胞收集的条件培养基显著抑制LX2细胞活化。

木犀草素在体内抑制和逆转B[a]P诱导的异常DR

动物实验显示，木犀草素联合处理组血清ALT、AST、GGT和ALP水平显著低于B[a]P单独处理组。组织学分析表明，木犀草素处理显著减少反应性胆管数量、降低GRP75表达、抑制EMT标志物表达、肌成纤维细胞活化和胶原沉积。在逆转实验中，与自我恢复组相比，木犀草素干预组显著降低血清肝酶水平，并明显逆转B[a]P预暴露引起的胆管异常增生、EMT标志物表达、αSMA水平和胶原沉积。

本研究深入揭示了低剂量B[a]P通过表观遗传机制持续激活GRP75表达，进而破坏内质网-线粒体稳态，导致线粒体Ca²⁺超载和ROS过量产生，激活EMT过程并诱导胆管细胞获得纤维化表型的完整分子通路。研究的创新性在于首次系统阐明了GRP75在环境毒素诱导胆管反应中的核心作用，并发现中药单体成分木犀草素可通过靶向GRP75实现对该病理过程的有效干预和逆转。

从机制层面来看，研究揭示了环境毒素表观遗传调控的新模式——B[a]P通过降低GRP75启动子区DNA甲基化水平实现其持续激活，这一发现为环境因素相关疾病的表观遗传机制提供了新见解。在病理生理层面，研究详细阐释了从细胞器交互失调（ER-线粒体偶联异常）到离子稳态失衡（Ca²⁺超载），再到氧化应激（ROS过量产生）和细胞表型转化（EMT）的级联反应过程，为理解肝胆纤维化发病机制提供了多维度视角。

尤为重要的是，研究通过系统性药物筛选和功能验证，将传统中药单体木犀草素与现代分子靶点GRP75精准关联，不仅证实了其结合活性和降解促进作用，更在体内外模型中验证了其防治效果，为环境相关性肝胆疾病的防治提供了具有转化价值的新策略。这一"病因-机制-干预"的完整研究范式，为类似环境健康问题的研究提供了可借鉴的思路方法。

该研究的发现对于公共卫生领域具有重要意义：一方面为环境B[a]P暴露的肝胆系统危害提供了机制解释和生物标志物（GRP75）参考；另一方面为开发针对环境毒素相关疾病的新型防治策略提供了理论依据和候选物质。未来研究可进一步探索GRP75在其它环境毒素致肝胆疾病中的作用，扩大木犀草素类似物的筛选范围，并推动相关制剂向临床转化应用。