E3泛素连接酶Cbl-b与c-Cbl通过调控M-CSF/M-CSFR信号轴维持巨噬细胞稳态的机制研究

本刊推荐：巨噬细胞稳态失衡可引发严重免疫疾病，但其调控机制尚不明确。本研究聚焦E3泛素连接酶Cbl-b/c-Cbl对M-CSFR信号的调控作用，发现Cbls通过介导M-CSFR的K63泛素化及溶酶体降解，抑制AKT/Erk过度激活，从而维持巨噬细胞增殖与凋亡平衡。基因双敲除小鼠出现自发性肺巨噬细胞增生病变，证实Cbls在体内稳态调控中的关键作用，为靶向M-CSFR通路治疗巨噬细胞相关疾病提供新策略。

　　

在免疫系统的精密调控网络中，巨噬细胞作为先天免疫的核心力量，不仅承担着吞噬清除病原体的重任，更是组织稳态维护和损伤修复的关键执行者。然而，巨噬细胞数量的精确调控一直是免疫学领域的核心问题——过多或过少的巨噬细胞都会导致免疫系统功能紊乱，引发一系列疾病。尽管已知巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）及其受体（M-CSFR）信号通路是调控巨噬细胞增殖和存活的核心途径，但该通路如何被精确调控以避免过度激活，至今仍是未解之谜。

Casitas B淋巴瘤家族蛋白（Cbl）作为关键的E3泛素连接酶，在淋巴细胞和树突状细胞中的调控作用已被广泛报道，但它们在巨噬细胞生物学中的功能，特别是在体内稳态维持中的作用，始终缺乏直接证据。这就引出了一个关键科学问题：Cbl家族蛋白是否通过调控M-CSFR信号通路来维持巨噬细胞稳态？为了回答这个问题，研究人员开展了一项深入系统的研究，其成果发表在《Cell Death and Disease》期刊上。

研究团队采用多种关键技术方法：首先通过条件性基因敲除技术构建巨噬细胞特异性Cbl-b/c-Cbl双敲除（dKO）小鼠模型；利用体外骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养体系进行功能验证；采用免疫共沉淀和Western blot分析蛋白质相互作用与修饰；通过流式细胞术检测细胞增殖（BrdU掺入法）和凋亡（Annexin V/7AAD染色）；使用实时定量PCR分析基因表达；借助整体体积描记术（WBP）评估小鼠肺功能；并通过对人源THP-1细胞系的平行实验验证机制的普适性。

Accelerated proliferation and improved survival of Cbls-deficient BMDMs

研究发现Cbl-b/c-Cbl双敲除（dKO）巨噬细胞在M-CSF刺激下形成更多、更大且更密集的细胞克隆，细胞数量显著增加。通过BrdU掺入实验证实dKO巨噬细胞增殖能力增强，而细胞凋亡比例显著降低。周期调控基因c-Myc、Cyclin D1和Cyclin D2的表达上调，表明Cbls缺失通过促进细胞周期进程增强增殖能力。

dKO BMDMs exhibit prolonged AKT and Erk activation upon M-CSF stimulation

机制研究表明，dKO巨噬细胞在M-CSF刺激下呈现AKT和Erk信号的持续活化。Western blot分析显示磷酸化AKT和Erk水平在刺激后20-30分钟仍维持高位，6小时后仍可检测到显著激活。凋亡相关蛋白检测发现Cleaved caspase-3/7/9和促凋亡分子Bim表达降低，而抗凋亡分子Bcl-xL表达升高，Puma蛋白水平也显著下降。

Cbls collaboratively inhibit M-CSF-dependent cell proliferation and promote cell apoptosis by down-regulating M-CSFR protein levels

研究发现dKO巨噬细胞中M-CSFR蛋白水平显著上调，而mRNA水平无变化，表明Cbls在翻译后水平调控M-CSFR。使用M-CSFR特异性抑制剂BLZ945处理可逆转dKO巨噬细胞的过度增殖和凋亡抵抗表型，并抑制AKT/Erk的过度激活。

Cbls mediate the ubiquitination and subsequent degradation of M-CSFR in response to M-CSF induction

通过免疫共沉淀实验证实Cbl-b/c-Cbl与M-CSFR存在直接相互作用，且M-CSF刺激可增强这一结合。在HEK293T细胞和原代巨噬细胞中，Cbls过表达促进M-CSFR的泛素化和降解，而酶活缺失突变体（Cbl-b C373A/c-Cbl C379A）则丧失这一功能。溶酶体抑制剂氯喹（CQ）可阻断Cbls介导的M-CSFR降解，而蛋白酶体抑制剂MG132无此作用，表明降解通过溶酶体途径进行。

Phosphorylation of Cbls and autophosphorylation of M-CSFR are critical for M-CSFR ubiquitination and degradation

研究揭示M-CSF刺激通过M-CSFR激酶活性诱导Cbls酪氨酸磷酸化（Cbl-b Tyr³⁶³/c-Cbl Tyr³⁶⁹），这些位点的磷酸化对泛素连接酶活性至关重要。同时发现M-CSFR自身酪氨酸磷酸化位点Tyr⁵⁵⁹是其被Cbls识别和泛素化的关键。

Cbls mediate the K63-linked polyubiquitination modification at Lys791 of M-CSFR

通过系统突变分析，研究发现M-CSFR的Lys⁷⁹¹是Cbls介导的K63连接多聚泛素化的关键位点。该位点的突变可完全阻断Cbls介导的M-CSFR泛素化和降解，且K63连接的特异性泛素化在体内外实验中得到验证。

The Cbls ablation alters the homeostasis of peripheral macrophages

体内实验显示dKO小鼠脾脏、肝脏和骨髓中巨噬细胞比例和绝对数量显著增加。更重要的是，dKO小鼠自发发展为以巨噬细胞增生为主的肺肿大病变，肺泡结构破坏，伴有广泛炎症细胞浸润和肺泡壁融合增厚。肺功能检测显示呼吸频率增加，潮气量降低，最终导致呼吸困难和小鼠早夭。

Abnormal macrophage accumulation in the lungs of dKO mice

进一步分析发现dKO小鼠肺泡巨噬细胞（AMs）和间质巨噬细胞（IMs）数量显著增加，细胞表面M-CSFR表达升高，增殖增强而凋亡减少。使用BLZ945抑制M-CSFR可部分缓解dKO小鼠的肺病理变化，证实表型依赖于M-CSFR信号过度激活。

研究结论与讨论部分强调，Cbl-b和c-Cbl通过协同作用介导M-CSFR的K63连接泛素化和溶酶体降解，从而负调控AKT/Erk信号通路，维持巨噬细胞数量稳态。这种调控机制在人体细胞（THP-1）中也得到验证，表明其跨物种保守性。研究首次提供了体内直接证据，证明Cbls缺失通过破坏M-CSFR信号负反馈机制，导致巨噬细胞异常增生和肺组织结构破坏。

该研究的重大意义在于揭示了巨噬细胞稳态调控的新机制，为理解巨噬细胞相关疾病（如肺纤维化、自身免疫性疾病等）的发病机制提供了新视角。针对Cbls-M-CSFR调控轴的药物开发，特别是E3泛素连接酶激动剂的研发，可能为治疗巨噬细胞异常增生性疾病提供新的治疗策略。同时，研究提醒在针对M-CSFR的临床治疗（如癌症免疫治疗）中，需要充分考虑其对巨噬细胞稳态的潜在影响。