SH2结构域介导的C2结构域空间阻遏调控SHIP1肌醇5-磷酸酶的自抑制机制

本研究揭示了SHIP1磷酸酶自抑制的结构基础：通过HDX-MS和单分子成像技术，发现其N端SH2结构域与C2结构域的CBL1基序形成分子内相互作用，空间阻碍膜结合界面；突变CBL1基序或替换SH2结构域可解除自抑制，增强膜结合频率和催化效率，为靶向SHIP1的免疫疾病治疗策略提供了新见解。

　　

在免疫细胞信号传导过程中，磷酸肌醇脂质扮演着至关重要的角色。其中，磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸（PI(3,4,5)P₃）作为第二信使，调控着细胞迁移、内吞和膜振荡等关键生理过程。而含有SH2结构域的肌醇多磷酸5-磷酸酶1（SHIP1）作为造血细胞特异性的酶，负责将PI(3,4,5)P₃去磷酸化生成PI(3,4)P₂，从而精细调控免疫反应。SHIP1功能异常与多种疾病密切相关：在髓系细胞中，其表达改变会扰乱细胞趋化和分化，导致慢性粒细胞白血病；在中枢神经系统，小胶质细胞中的SHIP1失调已被关联到阿尔茨海默病的发病机制。

尽管SHIP1的重要性毋庸置疑，科学家们对其分子调控机制的理解仍存在重大空白。此前研究发现SHIP1存在自抑制现象，其N端SH2结构域能够抑制磷酸酶活性，而这种抑制可被膜表面或溶液中的受体源性磷酸酪氨酸（pY）肽段解除。然而，自抑制的具体结构基础、分子间相互作用界面以及调控膜定位的机制始终未被阐明。理解这些机制对于开发调控SHIP1膜定位和活性的治疗策略具有关键意义。

为回答这些问题，Emma E. Drew等研究者在《Journal of Biological Chemistry》上发表了最新研究成果。他们通过多学科交叉方法，包括氢氘交换质谱（HDX-MS）、单分子全内反射荧光显微镜（smTIRF-M）和体外脂质磷酸酶活性测定等技术，揭示了SH2结构域通过空间阻遏C2结构域介导的膜结合来调控SHIP1自抑制的分子机制。

研究采用的关键技术方法包括：1）构建最小自抑制单元mSHIP1(ΔCTD)用于结构生化研究；2）运用氢氘交换质谱（HDX-MS）解析pY肽段引起的构象变化；3）通过体外支持脂质双层（SLB）体系结合单分子成像技术量化膜结合动力学；4）利用AlphaFold2/3进行结构预测和模型构建；5）在中性粒细胞样细胞（PLB-985）中进行单分子膜结合验证。

A minimal SHIP1 protein that exhibits SH2-mediated autoinhibition

研究人员首先构建了缺失C端结构域（CTD）的最小自抑制单元mSHIP1(ΔCTD)，该蛋白保留了完整的自抑制特性且能被pY肽激活。通过体外脂质双层实验发现，mSHIP1(ΔCTD)与全长SHIP1同样表现出约5倍的活性抑制，而中央催化模块（PH-PP-C2）则呈现组成型活性。pY肽在溶液中对两者都能有效解除自抑制。

HDX-MS reveals pY peptide mediated conformational changes in autoinhibited SHIP1

通过HDX-MS技术，研究发现pY肽引起SH2结构域和C2结构域的溶剂可及性显著变化。特别值得注意的是，C2结构域中的无序CBL1基序（740-748位氨基酸）在pY肽存在时显示溶剂暴露增加。AlphaFold结构预测支持SH2与C2结构域间存在分子内接触的模型。

Mutations in the C2 domain disrupt SHIP1 autoinhibition

基于HDX-MS结果，研究人员对CBL1基序进行突变分析。发现将保守的赖氨酸残基突变为天冬氨酸（K741D/K743D/K747D，称为3D突变）或全部丙氨酸突变（7A突变）能显著增强磷酸酶活性，使其达到与组成型活性PH-PP-C2相当的水平。而中性突变（3A）则不影响自抑制状态。

CBL1 motif mutants maintain sensitivity to phosphatidylserine lipids

进一步实验表明，CBL1基序突变不影响SHIP1对磷脂酰丝氨酸（PS）脂质的敏感性。在含有20% PS的脂质双层上，突变体和野生型的活性增强趋势保持一致，说明CBL1突变特异性地影响SH2介导的自抑制而非PS结合功能。

Autoinhibition reduces the membrane binding frequency of SHIP1

单分子成像结果显示，自抑制状态显著降低SHIP1的膜结合频率。mNG-mSHIP1(ΔCTD)的膜结合频率比组成型活性PH-PP-C2低4.7倍，结合速率常数（k_ON）低8.3倍。CBL1突变体（3D和7A）则表现出中间状态的膜结合能力，证实了SH2对C2结构域膜结合的空间阻碍作用。

Dimerization modulates SHIP1 membrane binding and apparent phosphatase activity

研究发现二聚化通过RhoA结合结构域（RBD）增强SHIP1膜定位和表观磷酸酶活性。含有RBD的二聚化 competent 构建体显示更长的膜停留时间和更慢的扩散速率，但二聚化并非自抑制所必需。

研究结论表明，SHIP1自抑制主要由SH2结构域与C2结构域CBL1基序间的弱分子内相互作用介导，通过空间阻碍C2结构域的膜结合界面来实现。这一机制使得SHIP1活化更依赖于细胞信号过程中产生的酪氨酸磷酸化肽段。二聚化则通过增加膜停留时间进一步增强表观活性。该研究不仅阐明了SHIP1自抑制的分子基础，还为开发靶向SH2-C2界面、调节SHIP1膜定位和活性的治疗策略提供了重要理论基础。针对CBL1基序的突变策略可能成为治疗SHIP1相关免疫疾病和神经退行性疾病的新方向。