非保守整合素胞质区通过调控talin1结合动力学决定整合素亚型特异性功能

本刊推荐：为解决整合素亚型与talin1相互作用的差异机制问题，研究人员开展了关于WN linker调控整合素-talin1结合动力学的主题研究，发现β2整合素特有的NND序列通过增强talin1结合亲和力促进淋巴细胞粘附，而β7整合素的KQDS序列则削弱相互作用，该发现为开发整合素亚型特异性药物提供了新靶点。

　　

在免疫应答和炎症反应中，淋巴细胞在血管内的滚动和黏附是关键步骤，这一过程主要由整合素家族膜受体介导。整合素是由α和β亚基组成的异二聚体跨膜受体，其功能多样性源于对配体（如细胞外基质蛋白和细胞表面分子）的特异性识别。尽管配体结合存在差异，大多数整合素都共同与talin相互作用——这是一种关键的细胞骨架衔接蛋白，通过诱导整合素构象变化至活性状态来激活整合素。

然而，不同整合素亚型与talin的相互作用是否存在差异，以及这种差异如何影响整合素功能特异性，长期以来并不清楚。特别是在淋巴细胞中，β2整合素LFA1（αL/β2）与β7整合素α4/β7虽然都能介导淋巴细胞黏附，但它们的黏附特性存在显著差异：LFA1-ICAM1相互作用介导的黏附表现为急剧的从滚动到停滞的转变，而α4/β7-MAdCAM1相互作用则表现为渐进的转变过程。这种功能差异是否源于它们与talin1结合特性的不同，是本研究要解决的核心问题。

为了回答这个问题，Naoyuki Kondo等研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们发现整合素β亚基胞质尾部中一个被称为WN linker的非保守区域，能够调控talin1结合动力学和整合素黏附性，从而决定整合素亚型特异性功能。

研究人员运用了几个关键技术方法：首先建立了活淋巴细胞内单分子成像系统，通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）实时观察talin1与整合素胞质尾部的结合动力学；其次构建了嵌合整合素表达系统，在Ba/F3细胞系中表达不同胞质尾部的整合素变体；还采用了GST pull-down assay分析体外结合特性；通过AlphaFold2进行结构预测和分子建模；使用FRET张力传感器监测talin1受力情况；并利用Octet生物层干涉测量系统定量分析结合亲和力。

Differences in integrin-dependent adhesiveness

研究人员首先比较了LFA1和α4/β7介导的淋巴细胞黏附强度。静态黏附实验显示，即使在最大配体浓度下，LFA1依赖的黏附也强于α4/β7依赖的黏附，表明LFA1-ICAM1相互作用本质上强于α4/β7-MAdCAM1相互作用。

Single-molecule binding assay

通过体内单分子talin1结合分析系统，研究人员发现talin1与β2整合素的结合频率和结合时间均显著高于与β7整合素的结合。在初始和激活的T细胞中，talin1与β2的结合解离速率常数均低于与β7的结合，表明talin1与LFA1的结合比与α4/β7的结合更紧密。

Chimeric integrins to determine net effect of the integrin cytoplasmic tail on talin1 binding

为了消除配体特异性和整合素表达水平的混杂影响，研究人员构建了嵌合整合素，将β2-CT替换为β3或β7的CT。这些嵌合整合素减弱了细胞黏附性并降低了talin1结合动力学，重现了β3和β7的表型。即使在使用ΔGFFKR突变体组成性打开整合素 clasp 的情况下，β7-CT仍显示出比β2-CT更弱的talin1结合亲和力和淋巴细胞黏附性。

Biophysical properties of the binding of the β2 and β7 tails to talin1

体外pull-down实验证实，talin1-FERM结构域与GST-β2-CT的结合强于与GST-β7-CT的结合，支持体内观察到的结合差异。

Comparison of forces imposed on talin1 between β2 and β7

通过talin1张力FRET传感器，研究人员发现表达αL/β2的淋巴细胞比表达αLα4/β2β7的细胞具有更弱的FRET信号，表明β7对talin1施加的力比β2弱，这与其较低的结合亲和力一致。

New motif governing differences in talin1 binding to integrins

通过比较β2和β7的CT序列，研究人员发现了一个位于保守Trp747和NPLF motif之间的连接区，并将其命名为WN linker。结构模型显示，β2-CT中的WN linker（NND）形成β-链与talin1整合成β-片层，而β7-CT中的WN linker（KQDS）则向外突出。将β2-CT中的NND序列替换为KQDS（β2-KQDS）减弱了ICAM1依赖的黏附，并降低了talin1结合频率和持续时间。相反，将β7-CT中的KQDS替换为NND（β7-NND）增强了黏附性和talin1结合强度。

WN linker突变还影响了LFA1构象激活。 inside-out信号刺激后，表达αL/β2（WT）的淋巴细胞表现出明显的活性构象诱导，而表达αL/β2-KQDS的细胞则没有活性构象变化。高浓度ICAM1诱导的outside-in信号也受到WN linker替换的抑制，表明WN linker通过调控talin1结合强度促进LFA1构象激活。

多重序列比对分析显示，三残基NND序列是β2整合素独有的，且主要限于哺乳动物。第二个天冬酰胺（N749）在哺乳动物β2直系同源物中高度保守，且不存在于其他整合素CT中。结构建模显示N749侧链与talin1的W359近距离接触，可能形成氢键和范德华相互作用。N749A突变显著降低了ICAM1黏附性和talin1结合，证实了N749在稳定talin1-β2相互作用中的关键作用。

Functional role of the WN linker in other integrins

研究人员进一步分析了其他整合素中WN linker的功能相关性。除β2外，所有检查的整合素（β1、β3、β5、β6、β7）都含有四残基WN linker。结构模型表明β1-CT和β3-CT采用与β7-CT相似的WN linker构象。

将β3-CT中的WN linker替换为NND（β3-NND）增强了αL-ΔGFFKR/β2β3细胞的黏附性，表明β3中的WN linker与β7类似，对整合素黏附性产生抑制作用。单分子结合分析和pull-down实验均证实β3与talin1的结合弱于β2，而WN linker替换增强了talin1结合。

Natural ligand-induced talin binding to β3 integrins in T cells

在原发性T细胞中，研究人员评估了talin1与天然β3整合素相互作用的动力学。使用PECAM1作为特异性配体，他们观察到T细胞对PECAM1包被表面的剂量依赖性黏附，尽管弱于对ICAM1的黏附。体内单分子talin1结合分析显示，在初始T细胞和Th2偏斜的T细胞中，talin1与αVβ3的结合显著弱于与αLβ2的结合，β3的解离速率也高于β2，表明β3整合素也具有抑制型WN linker，其talin1结合能力弱于β2整合素。

研究结论与讨论部分强调，本研究通过体内单分子整合素-talin1-CT结合分析，发现了一个以前未表征的talin1结合区域——WN linker。虽然大多数整合素-CT含有四残基WN linker，但β2-CT独特地拥有三残基变体（NND）。将β2-CT中的NND序列替换为来自β3或β7的四残基WN linker显著削弱了talin1结合并降低了淋巴细胞黏附性。相反，将β3或β7-CT中的四残基WN linker替换为NND增强了talin1结合并增加了黏附性。第二个天冬酰胺（N749）在介导talin1结合和促进淋巴细胞黏附中的关键作用进一步支持了这一观点。

这些发现建立了WN linker作为整合素-talin1相互作用的关键决定因子，直接调控细胞黏附。研究还更新了LFA1激活模型：配体结合和outside-in信号比inside-out信号更频繁、更长时间地促进talin1与LFA1的结合。 following配体结合和相关构象变化后，触发正反馈循环，驱动进一步的talin1招募和LFA1在接触界面的积累。Inside-out信号作为启动这一反馈激活的先决条件，而WN linker在这一过程的最早步骤中通过促进talin1与β2 CT相互作用的稳定性发挥关键作用。

WN linker具有临床治疗潜力。虽然许多LAD-I相关突变已被鉴定，但WN linker区域内尚未有报道。相反，β2整合素过表达与炎症性疾病相关，如类风湿性关节炎、骨关节炎和系统性硬化症。靶向WN linker的抑制性肽或小分子可以减轻这些疾病中的病理性整合素激活，同时最大限度地降低LAD-I风险，从而开辟新的治疗途径。