去泛素化酶OTUD4通过抑制TAK1激酶依赖性NF-κB信号通路调控炎症反应

本研究揭示了去泛素化酶OTUD4通过直接作用于TAK1信号复合体，特异性去除K63连接的多聚泛素链，从而抑制TNF诱导的NF-κB信号通路和慢性炎症激活。研究人员发现肿瘤相关突变体OTUD4 H148Y虽保留底物结合能力却完全丧失酶活性，导致促炎信号持续活化，为炎症驱动肿瘤发生提供了新机制见解。

　　

慢性炎症是许多癌症发展的关键驱动因素，尤其在非小细胞肺癌（NSCLC）等恶性肿瘤中，持续活化的核因子κB（NF-κB）信号通路创造了促进肿瘤生长的微环境。转化生长因子β激活激酶1（TAK1/MAP3K7）作为该通路的核心节点，其活性受泛素化修饰的精确调控——K63连接的多聚泛素化激活TAK1信号复合体，而去泛素化酶（DUBs）则负责移除这些激活链。然而，维持这种平衡的具体分子机制，特别是哪些DUBs直接作用于TAK1信号复合体，尚未完全阐明。

卵巢肿瘤结构域蛋白酶OTUD4作为OTU家族成员，已被发现通过情境依赖性机制调控多种细胞过程。前期研究表明其具有两种功能模式：非催化性的支架功能可稳定DNA烷化修复酶；而经酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化激活的内在催化活性则可衰减MyD88依赖性信号。然而，OTUD4是否调控TNF触发的、不依赖MyD88的炎症通路仍属未知。更引人注目的是，在嗜铬细胞瘤中发现的OTUD4 H148Y错义突变恰好位于催化必需的组织酸环（His loop），暗示其可能引起功能损伤，但这种结构局灶性替代如何影响OTUD4功能及其对炎症信号的调控机制仍待揭示。

针对这些科学问题，湖南师范大学生命科学学院赵宇教授团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了创新性研究成果。研究人员通过综合运用分子生物学、生物化学和细胞生物学等多学科技术方法，包括：蛋白质纯化与体外去泛素化活性分析、免疫共沉淀和体外pull-down检测蛋白质相互作用、免疫荧光染色观察蛋白亚定位与共定位、qRT-PCR定量炎症因子基因表达、以及Halo-NZF2亲和纯化特异性富集K63连接的多聚泛化蛋白等技术手段，系统揭示了OTUD4在炎症信号调控中的新功能机制。

肿瘤相关OTUD4 H148Y变异体完全丧失内在K63和K48连接的去泛素化酶活性

研究人员首先对肿瘤相关的OTUD4 H148Y错义变异体（c.442C>T, p.H148Y）进行了功能表征。该变异位于OTU结构域高度保守的催化His环内。通过体外去泛素化实验发现，无论是针对K63连接还是K48连接的多聚泛素链，H148Y变异体都完全丧失了催化活性，与活性位点突变体C45A和组氨酸-丙氨酸替代对照H148A表现一致。值得注意的是，当使用从HEK293T细胞纯化的全长OTUD4蛋白时，H148Y仍能切割K48连接链，进一步研究发现这种活性源于其完好的支架结构域招募的细胞去泛素化酶（如USP7），而非内在催化活性。重要的是，H148Y保留了Ser202磷酸化、UIM介导的泛素链结合以及与USP7的相互作用，表明该变异体实现了招募功能与催化活性的分离。

OTUD4与TAK1信号复合体相互作用

通过早期的蛋白质组学筛查发现TAK1及其伙伴TAB1、TAB3是OTUD4的潜在相互作用蛋白。免疫共沉淀实验证实了这一发现，并显示OTUD4与TAK1的相互作用最为显著。重要的是，催化失活的H148Y变异体与TAK1/TAB1/TAB3复合体的结合能力与野生型相当，表明这种相互作用不依赖OTUD4的催化活性。缺失作图实验将相互作用区域定位于N端OTU结构域（氨基酸1-180），AlphaFold2结构模型预测了OTU结构域与TAK1之间的接口。内源性实验证实了OTUD4与TAK1在NSCLC H1299细胞中的相互作用和胞质共定位，体外pull-down实验进一步证明这种相互作用是直接的。

OTUD4通过K63连接活性去泛素化TAK1，该功能被H148Y变异体废除

研究人员进一步探究了OTUD4对TAK1的去泛素化作用。细胞内的去泛素化实验表明，野生型OTUD4能显著降低TAK1的总泛素化和K63连接的特异性泛素化，而催化失活的C45A突变体则无此效果。更重要的是，H148Y变异体也失去了减少TAK1泛素化的能力，证实其内在催化活性缺陷导致了功能丧失。

OTUD4抑制持续的TNF诱导的NF-κB激活，该功能在H148Y变异体中受损

为了探究OTUD4-TAK1相互作用对下游信号的功能影响，研究人员比较了野生型（OTUD4^+/+）和OTUD4基因敲除（OTUD4^-/-）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）对TNF刺激的反应。OTUD4缺失导致TAK1磷酸化延长和IκBα降解持续。回补实验表明，野生型OTUD4能抑制持续的TAK1磷酸化并恢复IκBα周转，而H148Y变异体则无法实现挽救。在NSCLC H1299细胞中敲低OTUD4也再现了持续的IκBα降解，且只能被野生型OTUD4回补挽救。通过Halo-NZF2亲和纯化富集K63连接的多聚泛素化蛋白发现，OTUD4缺失细胞中TAK1和TAB3的K63连接泛素化显著且持续增加，这种增加能被野生型OTUD4回补逆转，但H148Y变异体无效。

OTUD4缺陷促进p65的持续核定位和炎症基因表达

研究人员评估了持续TAK1激活的下游后果。在TNF刺激的MEFs中，虽然TNF能快速诱导p65核输入，但在野生型细胞中120分钟后p65会输出回细胞质，而在OTUD4^-/-细胞中p65持续存在于核内。在巨噬细胞样RAW 264.7细胞中敲低OTUD4导致TNF刺激后促炎细胞因子基因IL-6和IL-1β的持续高表达。

H148Y变异体维持NF-κB激活并加剧炎症反应

回补实验显示，在OTUD4^-/- MEFs中重新表达野生型OTUD4可恢复正常的p65核输出，而H148Y变异体则无法实现，导致p65持续核积聚。在OTUD4敲低的RAW 264.7细胞中，H148Y变异体也未能抑制TNF诱导的IL-6表达升高。这些发现表明，肿瘤相关H148Y变异体丧失内在催化活性导致持续的NF-κB反应和增加的促炎基因表达。

这项研究揭示了OTUD4抑制炎症信号的一种新机制：通过直接作用于TAK1信号复合体，利用其催化His环依赖性活性特异性去除K63连接的多聚泛素链。研究的关键在于使用肿瘤相关的H148Y变异体作为分子工具，成功分离了OTUD4的内在催化功能与其支架功能。这种功能分离表明，对TAK1信号复合体的去泛素化抑制需要内在的OTUD4催化活性，而不依赖于其招募其他DUBs的能力。

该研究的发现将OTUD4功能障碍与炎症驱动肿瘤发生直接联系起来。虽然H148Y变异体最初在嗜铬细胞瘤中发现，但其分子机制——丧失内在催化活性导致促炎信号持续激活——为理解OTUD4在其他癌症（如NSCLC）中可能的作用提供了框架。研究结果表明，其他功能缺失的OTUD4变异体也可能通过类似的机制破坏炎症平衡，促进肿瘤发生。

综上所述，本研究不仅发现了NF-κB信号通路的一个新的调控节点，而且为理解去泛素化酶变异在癌症发病机制中的作用提供了重要的分子见解，为未来针对OTUD4及其相关通路的治疗策略开发奠定了理论基础。