果蝇体内硫酸软骨素(CS)生物合成基因的功能解析：揭示无脊椎动物中Csgalnact与C4st的独特作用

本刊推荐：为解析无脊椎动物硫酸软骨素(CS)生物合成机制，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了果蝇Csgalnact与C4st基因突变体。研究发现Csgalnact缺失仅导致中枢神经系统CS含量适度降低，而C4st突变则完全消除CS链4-O-硫化(4S)并引发代偿性软骨素产量增加。该研究揭示了无脊椎动物CS生物合成的独特调控模式，为研究CS蛋白聚糖(CSPGs)在神经系统功能中的作用提供了重要工具。

　　

在生命科学的糖生物学研究领域，硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate, CS)作为一类进化上高度保守的糖胺聚糖(glycosaminoglycans)，通过与核心蛋白共价结合形成硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs)，在细胞表面和细胞外基质中发挥着至关重要的作用。这些复杂的生物大分子参与调控多种发育和生理过程，包括细胞分裂、形态发生、干细胞多能性维持以及神经可塑性等。然而，当CSPGs的生物合成出现异常时，会导致包括骨骼疾病和癌症转移在内的多种病理状况。

尽管在脊椎动物特别是人类中，CS生物合成的分子机制已有较多研究，但在无脊椎动物模型中，这一过程的许多细节仍不清楚。以往对线虫(C. elegans)的研究表明，其CS生物合成系统与脊椎动物存在显著差异：线虫缺乏CSGALNACT同源基因，且主要产生非硫化的软骨素。这引出了两个重要科学问题：CSGALNACT酶在其他无脊椎动物物种中是否必需？CS硫化在无脊椎动物中具有怎样的生物学功能？

为了回答这些问题，研究人员选择利用模式生物果蝇(Drosophila)展开深入研究。果蝇基因组中包含至少四个CS生物合成酶基因——Chsy、Chpf、Csgalnact和C4st，分别对应人类的CHSY、CHPF、CSGALNACT1和CHST11同源基因。研究团队此前已经对Chsy和Chpf突变体进行了表征，发现CS缺失会导致基底膜结构完整性受损和器官形态维持异常。然而，对于另外两个关键基因Csgalnact(CS N-乙酰半乳糖胺转移酶)和C4st(CS 4-O磺基转移酶)在体内的功能，科学界仍知之甚少。

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了Csgalnact和C4st的无效突变体，并对其表型特征、CS生物合成变化以及行为学影响进行了系统分析。研究论文发表在《Journal of Biological Chemistry》上，为理解无脊椎动物CS生物合成的独特特征提供了重要见解。

研究人员运用了多项关键技术方法：利用CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接技术构建基因突变体；通过免疫组织化学和免疫印迹分析检测CS表达与分布；采用反相离子对色谱进行CS二糖结构分析；使用凝胶过滤色谱评估CS链长度变化；通过体外酶活性测定分析糖基转移酶功能；并利用幼虫运动轨迹追踪和成虫负趋地性行为实验评估神经系统功能。实验样本来自果蝇的幼虫中枢神经系统和成虫整体组织。

Generation of mutants for CS biosynthetic genes

研究人员成功构建了Csgalnact²¹²和C4st³⁴⁰两种突变体。Csgalnact²¹²突变体在蛋白质编码序列中存在1018 bp的大片段缺失，导致在Val207处产生截短蛋白，缺乏酶活性关键结构域。C4st³⁴⁰突变体则在Ser33位置存在单碱基缺失，引起阅读框移位，从而消除了磺基转移酶结构域。这两种突变体均被认为是无效等位基因。

Drosophila CS biosynthetic gene mutants

表型分析显示，Chpf和C4st突变体表现出与Chsy突变体相似的高致死率(92-97%)和翅膀成熟缺陷(折叠翅表型)。特别是C4st突变体的翅膀表型外显率为53-76%，明显低于Chsy和Chpf突变体。相反，Csgalnact突变体仅显示较低的致死率(约6.8%)，且几乎不出现翅膀异常(<1%)。通过act-Gal4驱动UAS-C4st表达可完全挽救C4st突变体的致死率和翅膀表型。

CS polymerization in CS biosynthetic mutants

免疫染色结果显示，Chsy、Chpf和C4st突变体的翅盘中均检测不到LY111表位(识别4-O硫化CS的特异性抗体)。然而，Csgalnact突变体的LY111信号与野生型无异。免疫印迹分析进一步证实，Chsy、Chpf和C4st突变体中高分子量CSPGs的 smear条带消失，而Csgalnact突变体仍保留这些条带，只是信号强度略低于野生型。

Glycosyltransferase activity of Csgalnact

酶活性测定表明，果蝇Csgalnact确实具有GalNAc转移酶活性，但其相对活性显著低于人源CSGALNACT1(约1:40)。这一结果证实了Csgalnact编码一种具有生物活性的GalNAc转移酶，尽管其体外活性相对较低。

CS disaccharide structures in CS biosynthetic mutants

二糖分析显示，Chsy和Chpf突变体中完全检测不到ΔDi-0S和ΔDi-4S二糖，证实了CS合成的完全缺失。C4st突变体则特异性缺失ΔDi-4S，但ΔDi-0S水平大幅增加，导致总CS含量升高。Csgalnact突变体整体CS含量和二糖组成与野生型相似，但在幼虫中枢神经系统中，总CS量显著降低约40%，表明该基因在神经系统中有特定功能。

CS chain length in Csgalnact mutants

凝胶过滤色谱分析发现，Csgalnact突变体中高分子量CS链分(约30 kDa)显著减少，最高峰向较小尺寸移动，表明该酶参与CS链的延伸过程。

Behavioral phenotypes of CS biosynthetic mutants

行为学实验显示，Chsy和Chpf突变体的幼虫运动速度显著降低，而Csgalnact和C4st突变体与野生型无差异。在成虫负趋地性实验中，Csgalnact和C4st突变体均表现出攀爬能力缺陷，其中C4st突变体表型更为严重。通过act-Gal4驱动相应基因表达可完全挽救这些行为缺陷。

研究结论与讨论部分强调，本研究揭示了果蝇CS生物合成系统的独特特征。与哺乳动物中CSGALNACT1的重要性形成鲜明对比的是，果蝇Csgalnact在CS生物合成中仅扮演相对次要的角色，其主要功能局限于中枢神经系统，影响CS链长度和神经系统功能。这表明果蝇Chsy可能像线虫Sqv-5一样，同时具备GalNAcT-I和-II活性，能够在没有Csgalnact的情况下催化CS链的起始。

另一方面，C4st突变体表现出更严重的表型，包括高致死率、翅膀成熟缺陷和成人攀爬行为异常，表明CS硫化在果蝇发育和生理中具有重要作用。特别有趣的是，C4st突变不仅消除了CS硫化，还引起了非硫化软骨素产量的代偿性增加，暗示存在一种反馈调节机制以最小化突变后果。

这些发现不仅增进了对无脊椎动物CS生物合成机制的理解，还为研究CSPGs在神经系统发育和功能中的作用提供了有价值的体内工具。未来研究可进一步探索Csgalnact在神经系统中的具体功能机制，以及CS硫化在神经肌肉系统中的作用方式，为相关人类疾病的机制研究和治疗策略开发提供新的思路。