内源性阳离子脂质与聚乙烯亚胺转染试剂在多种细胞系中介导DNA与mRNA递送的效率与细胞毒性系统评估

本研究针对不同转染试剂在多种细胞系中的效率与毒性差异问题，系统评估了阳离子脂质体（DOTAP/DOTMA与DOPE组合）和聚乙烯亚胺（PEI）等自备试剂对质粒DNA和mRNA的转染性能。研究发现DOPE:DOTAP与DOPE:DOTMA组合在mRNA转染中表现出高效性与低细胞毒性，且部分组合稳定性良好，为基因编辑、疫苗研发等应用提供了经济高效的转染方案选择依据。

　　

在分子生物学和生物医学研究中，将外源核酸有效导入细胞的转染技术是基因功能研究、蛋白表达和疫苗开发的基石。然而，商业化转染试剂（如Lipofectamine^TM 2000和Fugene^? HD）虽然效率较高，但价格昂贵，且其效率与细胞毒性往往因细胞类型而异，限制了大规模应用。与此同时，实验室自备的转染试剂如线性聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）和阳离子脂质——包括1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）和1,2-二-O-十八碳烯-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）与辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）的组合，虽成本较低，但其在不同细胞类型及核酸类型（DNA与RNA）中的性能缺乏系统评估。为此，来自赫尔辛基大学的研究团队开展了一项系统研究，对上述自备试剂及两种商业化试剂在14种不同来源细胞系中的转染效率、细胞毒性及复合物稳定性进行了全面评价，文章发表于《Journal of Biological Chemistry》。

研究团队应用了多项关键技术方法：包括通过琼脂糖凝胶电泳迁移实验分析核酸-转染试剂复合物的形成情况；使用自动化荧光显微镜技术定量分析转染效率；采用基于发光的细胞活力测定（CellTiter-Glo^? 2.0）评估细胞毒性；并测试了复合物在4℃储存不同时间（0、4和24小时）后的稳定性。实验中使用的细胞系涵盖人、猴、蛙、蛇及啮齿类来源的14种细胞，质粒DNA和mRNA均编码mCherry报告基因，便于直接观察和量化转染效果。

结合核酸能力分析

通过凝胶迁移实验评估各转染试剂与质粒DNA（pDNA）的结合能力。结果显示，PEI 25k在1:1比例时即可改变pDNA迁移率，4:1时游离pDNA完全消失，表明其能高效形成稳定复合物；PEI 40k结合效率稍低，但在高浓度下也表现出良好的复合能力。阳离子脂质DOTAP和DOTA与DOPE以0.5:1、1:1和2:1的摩尔比混合时，0.5:1比例显示出最强的结合能力，6:1–9:1比例时游离pDA基本消失；而2:1比例则效果最差。总体而言，PEI 25k在测试浓度下与pDNA的复合物最稳定。

pDNA与mRNA递送效率因细胞系而异

研究人员在14株细胞系中测试了十种转染试剂（包括Lipofectamine 2000、Fugene HD、两种分子量PEI及不同比例的DOPE:DOTAP/DOTMA）对pDNA和mRNA的递送效率。结果发现：

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  在易转染细胞如HEK293T中，Lipofectamine 2000对pDNA和mRNA的转染效率均较高（约60%和80%），而Fugene HD几乎不介导mRNA转染；DOPE:DOTAP（0.5:1）在mRNA转染中效率达60%。
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  在难转染细胞如Caco-2、AV3、Caki-1等细胞中，商业化试剂效率普遍较低（多低于5%），而DOPE:DOTMA（2:1）和DOPE:DOTAP（1:1）在mRNA转染中表现出色，效率可达70%–90%。
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  两栖类细胞（XTC）和爬行类细胞（I/1Ki）中，PEI 40k对mRNA的转染效率高达50%，而自备脂质体试剂效果有限。
  实验表明，自备脂质体试剂（尤其是DOPE比例较高的配方）在mRNA转染中普遍优于PEI及商业化试剂，且具有更宽的适用浓度范围。

转染试剂的细胞毒性评估

细胞毒性测试显示，Lipofectamine 2000和PEI（特别是25k）在多数细胞系中引发较高毒性（细胞死亡率可达60%–95%），而Fugene HD毒性中等（15%–65%）。相比之下，DOPE:DOTAP和DOPE:DOTMA配方（尤其是高DOPE比例）的细胞毒性较低（多低于25%），在敏感细胞系（如AV3、Caki-1、Calu-1和BVK-168）中仍保持较好可行性。例如，在BHK-21细胞中，DOPE:DOTAP（0.5:1）在实现40% mRNA转染效率的同时几乎未引起细胞毒性。

核酸-转染试剂复合物的稳定性

复合物稳定性测试显示，Lipofectamine 2000与pDNA形成的复合物在24小时内仍保持接近100%的转染效率，表现最佳；PEI 40k也较稳定（效率维持在80%左右），而PEI 25k和Fugene HD复合物效率随时间显著下降。在mRNA转染中，Lipofectamine 2000复合物在24小时后效率损失约15%；DOPE:DOTAP和DOPE:DOTMA配方在4小时内稳定性较好，但24小时后效率普遍下降。

本研究系统评估了多种自备与商业化转染试剂在广泛细胞类型中的性能，发现DOPE:DOTAP和DOPE:DOTMA配方（特别是0.5:1和1:1比例）在mRNA转染中兼具高效率、低毒性和较好的短期稳定性，是Lipofectamine 2000的有效替代方案。而PEI（尤其是40k）虽在pDNA转染中效果较好，但细胞毒性较高。这些结果为不同细胞类型和核酸类型的转染实验提供了选剂依据，显著降低了实验成本，并推动基因治疗和疫苗研发中转染技术的可及性与灵活性。该研究不仅提供了一套全面的转染试剂参考数据，还强调通过优化脂质组成和比例，可以在经济的前提下实现与商业化试剂相当甚至更优的转染效果。