离线多维逆流色谱技术在巴西绿蜂胶乙醇提取物中化学成分的分离与纯化中的应用

《Journal of Chromatography A》：OFF-LINE MULTIDIMENSIONAL COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY IN THE ISOLATION AND PURIFICATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS FROM THE ETHANOL EXTRACT OF BRAZILIAN GREEN PROPOLIS

二维逆流色谱法分离鉴定巴西绿蜂胶乙醇提取物中的92种化合物，通过LC/Q-TOF-MS初步筛查，结合第一维水相溶剂系统分离出 artepillin C、p-香豆酸及同系物，第二维非水相溶剂系统与Sephadex LH-20进一步纯化出抗肿瘤活性成分如prenylated cinnamic acid衍生物和萜类化合物。

　　巴西绿蜂胶是一种由蜜蜂从植物花蕾和分泌物中采集并加工而成的天然树脂，其化学成分复杂且具有多种生物活性。由于其丰富的化学组成，绿蜂胶在药理学和天然产物研究中备受关注。研究团队通过多维逆流色谱（MDCCC）技术，对绿蜂胶的乙醇提取物（EEGP）进行了系统的分离与纯化，最终成功鉴定了92种化合物，并从中分离出20种纯化合物。这一研究不仅有助于深入理解绿蜂胶的化学组成，也为后续的药理学研究和实际应用提供了重要的物质基础。

在研究过程中，团队首先利用液相色谱-时间飞行质谱（LC/Q-TOF-MS）对EEGP进行了初步筛选，以实现化合物的快速识别和注释。这种技术能够提供高分辨率的质谱数据，有助于解析复杂混合物中的化合物结构。通过LC/Q-TOF-MS的代谢指纹分析，研究者能够获取关于EEGP化学成分的详细信息，为后续的色谱分离步骤提供指导。在第一维色谱分离中，研究团队采用了一种水相双相溶剂系统，即己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:0.8:1:1，体积比），在正常等度洗脱模式下对EEGP进行了初步分离。这一步骤不仅获得了纯化的arteillin C和p-香豆酸，还得到了一些同分异构体，如capillartemisin A/B和aromadendrin-4’-O-甲基醚/二氢槲皮素。

为了进一步提高分离效果，研究团队在第二维采用了非水相溶剂系统，即己烷-氯仿-乙腈（1:0.1:1，体积比），在反相洗脱模式下对非极性部分进行了分离。结合凝胶渗透色谱（Sephadex LH-20）技术，团队成功分离出了anacardic acid 19:1以及其他酚类脂质衍生物和环阿屯烷三萜类化合物。这种多维分离策略不仅提高了分离的分辨率，还能够有效避免传统一维色谱技术在处理复杂混合物时的局限性。

多维逆流色谱（MDCCC）作为一种高效的分离技术，近年来在天然产物研究中得到了广泛应用。MDCCC通过将复杂混合物在第一维进行初步分离，然后将未分离的峰转移到第二维进行进一步分离，从而实现了对多种化合物的高效分离。这种技术的优势在于其无需固定相，避免了不可逆吸附的问题，同时能够实现高样品回收率和大规模处理。然而，传统的在线MDCCC技术通常需要配备多台设备，包括至少两台逆流色谱机（或逆流色谱与离心分配色谱（CPC）的组合），以及多个泵、切换阀、检测器和分馏收集器。这些设备的高成本和复杂操作限制了其在一些实验室中的应用，尤其是在设备资源有限的情况下。

因此，研究团队采用了离线MDCCC策略，即在第一维分离后，将感兴趣的组分转移到第二维进行进一步纯化。这种方法在设备资源有限的情况下尤为实用，因为它不需要复杂的在线连接，而是通过手动转移样品来实现多维分离。此外，团队还结合了凝胶渗透色谱（Sephadex LH-20）技术，在第二维对分离后的组分进行了进一步的纯化处理。这种策略不仅提高了分离的效率，还减少了样品在转移过程中的损失，从而保证了最终产物的纯度和产量。

绿蜂胶的化学成分主要包括多种酚类化合物、三萜类化合物以及黄酮类化合物。其中，一些重要的生物活性成分如arteillin C、baccharin、drupanin和capillartemisin等，因其在抗癌、抗炎等方面的潜力而受到广泛关注。此外，绿蜂胶中还含有多种黄酮类化合物，如aromadendrin-4’-O-甲基醚、二氢槲皮素、isosakuranetin、槲皮素和betuletol等，这些化合物在抗肿瘤、抗氧化等方面表现出良好的活性。同时，绿蜂胶中的酚类脂质衍生物，如anacardic acid 19:1，也被证实具有抗菌活性，特别是对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的抑制作用。

研究团队通过多维逆流色谱技术，不仅成功分离和纯化了上述多种生物活性化合物，还为绿蜂胶的标准化生产提供了新的思路。绿蜂胶的化学成分复杂，不同地区的绿蜂胶可能含有不同的化合物种类和比例，这给其标准化带来了挑战。通过系统化的分离策略，团队能够更精确地鉴定绿蜂胶中的主要和次要成分，从而为产品质量控制和药理活性研究提供可靠的数据支持。此外，研究还强调了代谢指纹分析在天然产物研究中的重要性，通过LC/Q-TOF-MS和APCI-Q-TOF-MS技术，团队能够快速识别和注释EEGP中的化合物，为后续的分离步骤提供明确的指导。

多维逆流色谱技术的应用，使得研究者能够在复杂的混合物中更有效地分离出目标化合物。这种技术的灵活性和高分辨率，使其成为处理天然产物复杂矩阵的理想选择。通过结合不同的溶剂系统和色谱模式，团队能够最大限度地提高分离的效率和选择性。此外，团队还指出，离线MDCCC策略在资源有限的实验室中具有显著优势，因为它能够降低设备需求，同时保持较高的分离质量。这种方法不仅适用于绿蜂胶的分离，也适用于其他天然产物的纯化研究。

在研究过程中，团队还特别关注了分离条件的优化。例如，在第一维使用水相双相溶剂系统时，团队选择了适当的溶剂比例和洗脱模式，以确保目标化合物的有效分离。而在第二维采用非水相溶剂系统时，团队通过调整洗脱条件，如洗脱速度和溶剂组成，进一步提高了分离的分辨率。此外，凝胶渗透色谱（Sephadex LH-20）的使用，使得团队能够在第二维对分离后的组分进行更精细的纯化处理。这种多层次的分离策略，不仅提高了目标化合物的纯度，还减少了杂质的干扰，为后续的生物活性研究提供了高质量的样品。

综上所述，该研究通过多维逆流色谱技术，成功分离和纯化了多种具有生物活性的化合物，为绿蜂胶的化学组成分析和药理研究提供了重要的基础。同时，研究还强调了代谢指纹分析在天然产物研究中的关键作用，以及离线MDCCC策略在资源有限情况下的应用价值。这些成果不仅有助于深入理解绿蜂胶的化学特性，也为其他天然产物的分离和纯化提供了可借鉴的方法。此外，研究团队的合作与贡献也体现了在复杂研究项目中，多学科协作和团队合作的重要性。