基于GC–MS/MS同步检测人成纤维细胞中过氧化物酶体β-氧化与醚脂生物合成关键代谢物的新方法及其应用

本研究开发了一种基于GC–MS/MS的高效分析方法，首次利用1-氯丁烷萃取技术，同步定量人成纤维细胞中过氧化物酶体β-氧化和醚脂生物合成的18种关键代谢物，包括VLCFAs、PUFAs、DCAs及ODG。该方法在X-ALD和ZWS患者细胞中成功验证，为 peroxisomal disorders 的代谢研究提供了可靠工具，显著提升多类别脂质代谢物同步检测的效率与准确性。

　　

在细胞代谢研究的广阔图景中，过氧化物酶体（peroxisome）作为关键的亚细胞器，承担着脂肪酸β-氧化和醚脂生物合成等重要代谢功能。然而，由于代谢通路的复杂性和代谢物性质的多样性，开发能够同步、高效、精准检测多类别代谢物的分析方法一直是个巨大挑战。尤其对于过氧化物酶体功能紊乱相关疾病，如X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）和Zellweger综合征（ZWS），缺乏可靠且全面的代谢物检测手段极大限制了其病理机制研究和诊断策略优化。

为解决这一问题，来自维也纳大学与维也纳医科大学的Karin Preindl、Thomas Stimpfl、Gunda Koellensperger、Fabian Dorninger、Johannes Berger和Christoph Wiesinger研究团队，在《Journal of Chromatography B》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）的高通量分析方法，实现了对人成纤维细胞中过氧化物酶体β-氧化和醚脂生物合成途径中关键代谢物的同步提取与定量分析。

该研究的主要技术方法包括：采用酸性水解和新型低毒性溶剂1-氯丁烷进行代谢物提取，利用动态多反应监测（dMRM）模式进行GC–MS/MS分析，结合同位素标记内标进行定量验证，并使用来自健康人、X-ALD和ZWS患者的原代人成纤维细胞作为样本队列进行方法验证与应用。

研究结果部分通过多个维度展开：

在“3.1. 方法开发”中，作者成功将六种饱和长链与极长链脂肪酸（如FA 14:0、FA 26:0）、九种多不饱和脂肪酸（例如FA 22:6 n-3）、两种二羧酸（16DCA和26DCA）以及1-O-十八烷基甘油（ODG）纳入同一检测面板，覆盖了过氧化物酶体代谢中的关键分子。

在“3.2. 样品制备与优化”中，研究发现酸性水解条件能更有效地释放鞘脂中的VLCFAs，而碱性水解释放能力有限。1-氯丁烷作为提取溶剂，相较于正己烷等传统溶剂，对极性代谢物如ODG和DCAs具有更高提取效率，且毒性低于氯仿。

“3.3. GC–MS/MS方法开发”详细描述了各代谢物的衍生化策略与质谱参数优化，通过硅烷化处理提高了色谱分离效果，并实现了n-3与n-6系列PUFAs的基线分离，避免了异构体干扰。

在“3.4. 方法验证与局限性”中，该方法在细胞基质中表现出良好的准确度（80–110%）和精密度（CV 6–20%），除个别高极性二羧酸外，绝大多数代谢物满足生物分析方法验证要求。

“3.5. ODG作为醚脂合成速率指标的有效性验证”是本研究的一大亮点。通过对比水解实验，证明ODG并非来自培养基中的磷脂降解，而是细胞内醚脂生物合成中间体的可靠指标，这为规避胎牛血清（FBS）中醚脂干扰提供了解决方案。

在“3.6. 应用于细胞样本”中，作者在来自健康人、X-ALD和ZWS患者的成纤维细胞中进行了方法应用。结果显示，X-ALD和ZWS细胞中FA 26:0显著积累，且FA 26:0/FA 22:0与FA 24:0/FA 22:0比值明显高于对照组，这与既往研究一致。此外，ZWS细胞中n-3系列PUFAs（如FA 22:6 n-3）水平显著下降，表明其β-氧化功能严重受损。ODG在ZWS细胞中几乎无法检出，印证了其作为醚脂合成标志物的敏感性。

研究的结论部分强调，本方法不仅为过氧化物酶体代谢研究提供了一种高效、可靠的分析工具，还拓展了对脂质代谢网络的理解。通过同步检测VLCFAs、PUFAs、DCAs及ODG，该方法能有效区分X-ALD和ZWS等疾病表型，并可用于机制研究与潜在治疗策略的评估。此外，ODG作为醚脂合成标志物的引入，为细胞水平研究醚脂代谢提供了新的思路，避免了过去依赖 plasmalogen 检测时受培养基干扰的问题。

本研究在代谢组学与疾病机制研究的方法学上具有重要意义。其低溶剂消耗、高提取效率和广泛的代谢物覆盖范围，使其特别适合临床应用和基础研究中的大规模样本分析。未来，这一方法有望扩展至其他细胞类型和临床样本，推动过氧化物酶体相关疾病诊断与治疗研究的进一步发展。