综述：双柱色谱技术在代谢组学中的进展：机遇、挑战与应用

《Journal of Chromatography Open》：Advances in Dual-Column Chromatography for Metabolomics: Opportunities, Challenges, and Applications

本文系统评估了双柱LC-MS在代谢组学中的应用，比较了靶向与非靶向方法，分析了平台配置、性能及优缺点，以解决传统单柱系统的局限性，如极性范围不足和分离能力有限。双柱系统结合正交分离化学（如RP-HILIC）可同时分析极性和非极性代谢物，提高分辨率和灵敏度，为疾病机制研究和精准医学提供更全面的数据支持。

　　代谢组学作为一门快速发展的组学学科，为研究生物系统中的生化状态提供了关键信息，并在生物标志物发现、疾病机制解析和精准医学等领域展现出巨大的潜力。随着临床和转化研究中对高通量、无偏见和可重复的代谢物分析需求不断增长，开发能够同时应对化学多样性、灵敏度和标准化的分析平台变得尤为重要。然而，传统的单柱色谱系统由于极性范围有限和分离能力不足，难以全面覆盖代谢物的复杂谱系，从而导致分析盲点和数据整合不充分的问题。为应对这些挑战，双柱系统作为一种有前景的解决方案应运而生，它通过将正相（RP）和亲水相互作用色谱（HILIC）等正交分离化学整合到单一分析流程中，显著提升了分析性能。这些系统能够同时分析极性和非极性代谢物，从而缩短分析时间、提高灵敏度并增强覆盖范围，特别是在结合靶向与非靶向代谢组学的混合设计中。

尽管双柱系统的应用逐渐增多，但对其设计、性能和在代谢组学中的优势进行全面评估仍显不足。本文系统性地回顾了1984年至2025年间发表的双柱液相色谱-质谱（LC-MS）应用研究，比较了靶向与非靶向方法，并评估了平台配置、分析能力及对工作流程标准化的贡献。同时，通过讨论关键的方法学方面，如样品制备、柱子设置、检测策略和数据分析，我们强调了这些系统如何影响数据质量，并促进稳健的生物学解释。这一全面的分析为双柱系统在代谢组学中的应用提供了重要的指导。

在代谢组学中，研究方法通常分为靶向和非靶向两种。非靶向方法旨在测量所有可检测的代谢物，包括未知化合物，从而提供全面、无偏见和高通量的数据，适用于新代谢物的发现和假设的验证。这类方法通常提供半定量数据，结果以峰面积或高度的形式报告。然而，非靶向方法往往面临定量能力有限、大量未识别化合物和较高的假阳性和假阴性风险，这增加了数据解释的复杂性。相比之下，靶向方法专注于特定代谢物的分析，能够提供更具选择性和灵敏度的定量数据，通常以摩尔浓度报告。然而，靶向研究受限于预定义的代谢物面板，且需要对每种目标化合物使用高灵敏度的同位素标记内标物才能实现准确的定量分析。将靶向与非靶向方法结合，有助于克服两者各自的局限性。

文献中经常提到靶向与非靶向方法的结合，被称为半靶向、混合或伪靶向代谢组学。然而，这些术语缺乏一致的定义，且常用于分析设计不同的工作流程。例如，一些被标记为半靶向的研究并未采用单次注射分析，这在术语使用上存在不一致。因此，这些标签可能描述的方法因研究目标和所用设备的不同而有所差异。因此，设计实验方案和选择分析策略时，必须充分考虑靶向和非靶向代谢组学的优势和局限性，以确保研究结果的可靠性和相关性。

尽管靶向和非靶向方法能够提供全面的代谢物分析，但它们在物理化学性质上存在显著差异，包括化学结构、pH值、溶解度和稳定性等。因此，先进的分离技术对于同时分析具有不同极性和溶解度的代谢物至关重要。液相色谱-质谱（LC-MS）及其先进的质谱分析器已成为代谢组学的重要工具，这得益于其多样化的分离机制和温和的离子化能力，使其优于基于核磁共振（NMR）的方法。这种成功主要归功于LC-MS在离子化前对复杂生物混合物中广泛代谢物的分离能力，从而减少离子抑制并显著提高分析灵敏度和检测可靠性。然而，传统的LC-MS代谢组学通常依赖于单一色谱柱，而代谢物广泛的化学多样性——从高度极性到高度非极性，从高度可溶到难溶——对全面分离构成了重大挑战。在这种情况下，代谢物的物理化学异质性使得单一固定相难以同时分析结构多样的化合物，特别是在复杂的生物基质中。

为了更清晰地展示这些差异，表1比较了单柱与双柱系统（如RP-HILIC）在靶向和非靶向代谢组学中的能力和局限性。双柱系统通过同时分析极性和非极性化合物，显著扩展了代谢物的覆盖范围，从而提高分析深度。然而，它们也引入了在样品制备、数据整合和系统维护方面的更高复杂性，需要先进的工作流程和坚固的仪器支持。在单维分离中，由于系统回压和分离时间的限制，峰容量有限。因此，多维分离技术因其在复杂混合物分离和分析中的应用而受到越来越多的关注。当单一分离模式无法保留所有分析物时，多维液相色谱（MD-LC）被采用，通过结合两种或更多互补的分离机制显著提升分辨率。在MD-LC中，分离机制通常是独立的或弱相关联的。为了获得最佳性能，两种分离维度必须兼容，以确保分析物从第一阶段有效转移到第二阶段。这些系统应设计为“正交”，以提供高分离容量和全面的分析物覆盖。

双柱系统在代谢组学中的应用，尤其是在非靶向研究中，往往避免使用衍生化，因为这会增加复杂性，可能改变代谢物的结构，并限制检测到特定的化合物类别，从而降低整体代谢物覆盖。随着现代色谱和检测技术的进步，双柱系统的高分离效率显著减少了对衍生化的依赖。然而，在某些特定情况下，如在*Aureobasidium*物种中使用AQC衍生化来分析氨基酸和肽类，衍生化仍然有用。

在代谢组学研究中，样品来源和分析目标对双柱系统的选取具有重要影响。不同生物样本的代谢物组成决定了最佳的柱子选择。例如，尿液通常富含极性代谢物，如氨基酸、有机酸和糖类，因此需要HILIC分离。而血浆和血清则含有极性代谢物和复杂的脂类，因此需要互补的策略。组织和细胞提取物的复杂性进一步增加了样品制备的难度，通常需要额外的步骤来有效提取极性范围内的代谢物。这些局限性促使双柱系统的广泛应用，它通过整合正交化学实现了对不同代谢物子集的同时捕获。

在双柱代谢组学中，特别是在非靶向研究中，衍生化通常被避免，因为这会增加复杂性，可能改变代谢物的结构，并限制检测到特定的化合物类别，从而降低整体代谢物覆盖。随着现代色谱和检测技术的进步，双柱系统的高分离效率显著减少了对衍生化的依赖。然而，在某些特定情况下，如在*Aureobasidium*物种中使用AQC衍生化来分析氨基酸和肽类，衍生化仍然有用。

在代谢组学研究中，样品来源和分析目标对双柱系统的选取具有重要影响。不同生物样本的代谢物组成决定了最佳的柱子选择。例如，尿液通常富含极性代谢物，如氨基酸、有机酸和糖类，因此需要HILIC分离。而血浆和血清则含有极性代谢物和复杂的脂类，因此需要互补的策略。组织和细胞提取物的复杂性进一步增加了样品制备的难度，通常需要额外的步骤来有效提取极性范围内的代谢物。这些局限性促使双柱系统的广泛应用，它通过整合正交化学实现了对不同代谢物子集的同时捕获。

双柱系统的应用在代谢组学中具有重要意义，其优势在于能够同时分离极性和非极性代谢物，从而提升分析的深度和广度。然而，其应用也面临一定的挑战，包括样品制备的复杂性、数据整合的难度以及仪器操作的复杂性。未来，随着技术的不断进步，双柱系统的标准化和自动化将有助于克服这些挑战，提高其在代谢组学研究中的应用效率和可靠性。此外，双柱系统的应用也推动了代谢物分析的多样化，使其在临床诊断、药物代谢研究和环境暴露分析等领域具有更大的潜力。