通过静电纺丝法制备聚丙烯腈/氧化石墨烯纳米纤维膜，随后利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）对苯并咪唑类杀菌剂进行分离和检测

《Journal of Chromatography A》：Electrospun polyacrylonitrile/graphene oxide nanofibers membrane followed by HPLC-MS/MS for the separation and determination of benzimidazole fungicides

Slalom色谱法（SC）在UHPLC中因高流速产生温度梯度，影响分离效率。研究显示，通过高真空环境（<10?? mbar）消除温度梯度，使4.6 mm内径SC柱的柱效提升30%，分辨率显著改善，为DNA/RNA分析等应用提供优化方案。

　　Slalom chromatography (SC) 是一种用于分离大分子生物聚合物的技术，近年来由于现代超高效液相色谱（UHPLC）仪器的发展而重新受到关注。该技术在高剪切条件下表现出最高的峰容量，通常发生在较高的流速下。高流速对于拉伸双链 DNA 和 RNA 生物聚合物至关重要，从而促进它们在 SC 柱中的保留。然而，在传统的静止空气烘箱环境中，当使用这种高流速时，粘滞加热会导致色谱柱中出现持续的径向温度梯度。这种热异质性会引发横向粘度和流速梯度，最终降低峰的形状和分辨率。

本研究探讨了在高真空环境中操作新型 SC 柱（Waters GT×Resolve 250 ? Slalom Column，MaxPeak Premier Technology，2.5 μm，4.6 × 300 mm）时，相较于标准大气条件下的性能提升。我们使用 1 kb DNA 梯度和 λ-DNA BstII 消化产物来评估线性双链 DNA 片段的分辨率。另一根填充了浅孔颗粒的色谱柱（Waters CORTECS TM HILIC Column，1.6 μm，4.6 × 150 mm）也被评估。实验结果显示，在真空环境下，色谱柱的分辨率显著提高，平均柱效增加了近 30%。这种性能提升归因于在 4.6 mm 内径的色谱柱中几乎完全消除了径向温度梯度。

这些发现强调了热管理在 SC 中的关键作用，并提出了通过高真空室或简单的真空夹套进行真空绝缘作为一项实用且有效的策略，以在 DNA/RNA 分析、细胞和基因治疗、限制图谱、拓扑异构体分离以及定向进化等应用中最大化分辨率。这些领域中，凝胶电泳仍然是传统基准，而 SC 作为一种快速、高分辨率、高准确性和高灵敏度的替代方法，正逐渐受到重视。

SC 是一种非平衡分离技术，它利用双链 DNA 和 RNA 生物聚合物的弱熵弹性。这些大分子具有较长的持久长度，约为单个碱基对长度的 150 倍，并且其松弛时间与延长长度和持久长度的平方成正比。研究表明，在含有亚 3 μm 颗粒的随机填充色谱柱中，产生的剪切力（通常为 1–2 pN）足以将 DNA 分子拉伸到其全长的近 80%。这种拉伸使得 DNA 在色谱柱中以细长的“蠕虫”状迁移，不再被颗粒表面排斥，并在靠近颗粒表面的位置经历最低的局部流速。迁移过程通过蠕动机制进行，交替地呈现折叠和拉伸的构象。值得注意的是，UHPLC 色谱柱中遇到的剪切力远低于导致双螺旋结构断裂的过度拉伸力（约 65 pN），并且远低于破坏磷酸二酯骨架的共价键断裂阈值（约 1000 pN）。因此，在典型的 UHPLC 剪切条件下，双链 DNA 和 RNA 保持结构稳定。

在实际应用中，一项新的商业 SC 色谱柱（Waters GT×Resolve 250 ? Slalom Column，MaxPeak Premier Technology，2.5 μm，4.6 × 300 mm）最近被开发出来，以应对新兴的生物分析挑战。这些挑战包括 DNA 限制图谱分析、质粒 DNA 拓扑结构表征、在体外转录（IVT）产生的 mRNA 中检测双链 RNA 杂质，以及定向进化库的生成和筛选。为了实现最佳选择性和分辨率，SC 色谱柱必须在高流速和压差下运行。然而，这些条件会导致粘滞加热并形成稳定的径向温度梯度，进而降低色谱柱的效率和分辨率。因此，研究如何减少这些横向温度梯度的幅度，以提升 SC 色谱柱的性能具有重要意义。

在本研究中，我们通过三个方面的研究来探讨这一问题：首先，通过实验测量在大气压下运行的 4.6 mm × 300 mm、2.5 μm Waters GT×Resolve 250 ? Slalom Column 的轴向温度梯度；其次，通过求解稳态热平衡方程来估计由此产生的径向温度梯度的幅度；最后，通过预测在色谱柱内径温度分布均匀的情况下，双链 DNA 分析物的柱效提升。这些理论预测随后与实验结果进行对比，实验结果是在色谱柱完全封装在高真空室（约 10^-5 mbar）中的情况下获得的。这种条件可以有效消除对流和传导热传递，确保色谱柱内径的准均匀热环境。

在理论部分，我们列出了稀释水性缓冲液的物理化学性质，这些性质随温度（20°C 至 40°C）和静水压力（0.1 至 100 MPa）的变化而变化。在稳态、时间不变的条件下，求解热平衡方程，并计算在运行 800 bar 压差时新型 SC 色谱柱（Waters GT×Resolve 250 ? Slalom Column，MaxPeak Premier Technology，2.5 μm，4.6 × 300 mm）的温度分布。实验部分中，我们使用了一种实验装置来测量不锈钢色谱柱外壁的轴向温度梯度。该装置在色谱柱的 28.5 cm 轴向位置安装了一个表面热电偶，用于校准聚酰亚胺贴片的发射率系数，以确保红外（IR）测量的准确性。

实验结果显示，在高真空环境中，色谱柱的性能得到了显著提升。这种提升主要体现在柱效的增加上，而柱效的提升与温度分布的均匀性密切相关。在常规大气条件下，由于粘滞加热的作用，色谱柱内部的温度分布并不均匀，导致横向的粘度和流速梯度，进而影响分离效果。而在高真空环境中，由于减少了热传导和对流的影响，色谱柱内部的温度分布更加均匀，从而降低了横向的梯度，提高了分离的效率和分辨率。

此外，我们还对不同类型的色谱柱进行了比较。其中，浅孔颗粒填充的色谱柱在某些情况下可能表现出不同的性能特征，这可能与颗粒的结构和表面特性有关。而新型 SC 色谱柱的设计则针对高剪切条件下的分离需求，通过优化颗粒的尺寸和排列方式，提高了对 DNA 和 RNA 的分离能力。实验结果表明，在高真空条件下，SC 色谱柱的分辨率显著优于常规大气条件下的结果，这表明真空环境对 SC 色谱柱的性能具有积极影响。

本研究还指出，即使是很小的径向温度梯度（如 0.3 K），也可能对 SC 色谱柱的效率和分辨率产生显著影响。这种影响主要体现在色谱柱内部的流速分布上，由于温度梯度的存在，导致色谱柱内的流速存在细微但重要的差异，从而扩大了色谱带的宽度，特别是对于那些本身具有较低迁移速率的大分子 DNA 或 RNA。因此，在高剪切条件下，为了提高分离效果，必须采取有效的热管理措施。

为了验证这一理论，我们设计了一套实验方案。首先，我们测量了在常规大气条件下运行的色谱柱的轴向温度分布，以了解温度梯度的幅度。接着，我们通过理论计算预测了在温度分布均匀的情况下，色谱柱的性能提升。最后，我们通过实际实验，在高真空条件下运行色谱柱，以验证理论预测的准确性。实验结果表明，在高真空条件下，色谱柱的性能确实得到了显著提升，这表明真空环境能够有效减少温度梯度的影响，从而提高分离效果。

综上所述，本研究强调了热管理在 Slalom 染色体技术中的重要性，并提出了通过高真空环境来改善 SC 色谱柱性能的策略。这一策略不仅可以提高分离的效率和分辨率，还可以在细胞和基因治疗、限制图谱分析、拓扑异构体分离以及定向进化等应用中发挥重要作用。随着生物分析技术的不断发展，SC 色谱柱的性能优化将成为一个重要的研究方向。