基于生物炭的混凝土作为一种生物相容性的建筑材料，用于海洋人工结构

《Journal of Environmental Management》：Biochar-based concrete as biocompatible building material for marine artificial structures

本研究通过实验室生物毒性测试和实地实验，评估了添加5%和10%生物炭的混凝土对海洋人工结构中微生物附着及宏观生物群落的影响。结果显示，生物炭混凝土未对海洋生物产生显著毒性，且在7天和45天微污染层群落结构上未发现统计学差异，宏观生物群落多样性及生物量也无显著变化，表明生物炭混凝土具有生态兼容性。此外，生物炭混凝土的碳封存能力较传统混凝土提升2-6%，机械性能更优，为海洋人工结构可持续发展提供了新方案。

　　在当前全球范围内，海洋和沿海地区广泛分布着各种人工结构，如港口、海岸防护设施以及能源生产或开采相关的基础设施。这些结构大多由混凝土构成，其覆盖面积在某些区域（如地中海和欧洲海域）可达海岸线的50%-60%。随着人类活动的不断扩张，未来这些人工结构的面积预计还会进一步增加。因此，如何通过新型解决方案提高这些海洋人工结构的可持续性，以管理海洋扩张并减轻其潜在的环境影响，成为一项重要的挑战。

为了增强人工结构的生态价值，已有研究尝试通过改变底质的宏观和微观地形来促进其作为栖息地增强器的作用，为海洋生物提供庇护所、育幼场所和适宜的定居空间。此外，一些研究还探索了将海洋人工结构作为废物再利用的工具，例如将传统材料（如天然砂和砾石）替换为生物来源的废料（如珊瑚碎屑、牡蛎壳）或人类活动产生的废弃材料（如建筑废料）。例如，牡蛎壳的添加已被证明能够提高贻贝的定居率，而将海螺壳加入混凝土混合物可能有助于提高底质上的生物覆盖度。然而，这些替代材料的引入可能仅对特定的分类群（如海鞘类）有益，从而导致传统混凝土和改良混凝土之间形成完全不同的生物群落结构。此外，某些情况下，这些替代材料的局部和有限可用性，或者去污染的限制，可能阻碍其系统的应用，而这些材料的生态友好型形状可能对减轻海洋建设的环境成本影响有限。

因此，了解生物炭混凝土是否能够与海洋应用相兼容，对于未来这种材料在沿海和海洋基础设施中的应用至关重要。本研究采用多学科方法，结合生态毒理学生物测定、DNA条形码技术和水下现场实验，对生物炭加入混凝土对海洋生物和人工硬底质的定殖过程的影响进行了全面评估。这些研究结果为生物炭混凝土在海洋环境中的应用提供了重要的依据。

在本研究中，我们选择了一种低污染含量的生物炭，其来源于植物生物质的热解过程。该生物炭具有较高的固定碳含量（>75%），粒径小于5毫米，其中约75%的颗粒尺寸小于2毫米。生物炭的化学污染水平较低，苯并[a]芘含量为1微克/千克，总多环芳烃（ΣPAHs）含量为0.5毫克/千克，远低于欧洲农业使用标准。

为了评估生物炭对海洋生物的潜在毒性，我们实施了一系列实验室生物测定实验。在这些实验中，我们选择了三种目标生物：*Artemia franciscana*（急性毒性测试，24小时死亡率）、*Brachionus plicatilis*（急性毒性测试，48小时死亡率）以及*Phaeodactylum tricornutum*（慢性毒性测试，72小时生长抑制）。这些实验分别采用了不同的方法，包括使用UNI EN 12457程序制备水提取物，以及按照意大利法律要求的ISPRA 16/2021协议进行的生态毒理学测试。实验结果显示，生物炭在所有测试中均未表现出显著的毒性效应，其最大观察效应百分比均低于通常认为具有生物学意义的阈值（即20%）。这表明生物炭对海洋生物的毒性影响较小，可以作为生态友好的材料使用。

在实验室和现场实验中，我们测试了三种类型的实验板：（i）传统混凝土作为对照底质，（ii）含有5%重量生物炭的混凝土，（iii）含有10%重量生物炭的混凝土。这些百分比代表了实际应用中可能遇到的生物炭含量，且不会影响或可能改善混凝土的机械性能。实验板的生产过程采用了商业混凝土（暴露等级：XS1-3，特定抗压强度：Rck 45 N mm?2，EN 206 UNI 11104），其中生物炭通过干混方法直接加入干料中，以确保其在混合物中的均匀分布。实验板在潮湿条件下反复搅拌后，被倒入15×10×2厘米的塑料模具中，并在常温（约20°C）和低光条件下固化。固化后的实验板被取出，并在中心钻孔以方便固定。总共生产了135块实验板（每种类型45块）。

实验地点选在意大利特雷蒂斯湾（北亚得里亚海），这是一个高度人工化的区域，海洋运输、沿海工业、渔业和旅游业高度集中。海底主要由沙子、黏土和淤泥组成，而海岸线则以人工礁石为主，由于高度的沿海城市化。我们在三个小型码头（S1、S2和S3）中随机选择作为实验地点，每个地点部署了45块实验板（每种底质15块），深度约为2米，位于潮间带。为了便于水下部署，实验板通过绳索和螺丝固定在五个半刚性塑料网格上，每个网格包含九块随机选择的实验板（每种底质三块）。这确保了所有实验板在研究期间保持垂直方向、稳定性和一致的环境条件（如光照和水动力）。为了避免不同实验板粗糙度对定殖过程的影响，我们确保实验板的光滑面暴露在开放水域中。实验从2024年7月开始，持续六个月，直至2025年1月结束。

在实验过程中，我们分别在浸入后7天和45天采集了实验板上的微生物附着物（即微生物生物膜和微型真核生物群落）。对于每个地点和采样时间，我们随机收集了三块实验板，并由水下潜水员将它们小心地放入塑料袋中。随后，我们直接在船上使用无菌棉签对每块实验板进行表面采样。采样后，棉签被放置在无菌Eppendorf安全锁管中，并在+4°C、黑暗条件下运输到实验室，随后在-20°C下储存以进行分子分析。对于固着的大型底栖生物，我们在浸入后60天、120天和180天分别从每个地点收集了三块重复实验板，并将其存放在海水中，以保持其自然状态，随后运输到实验室进行后续分析。

为了分析微生物附着物，我们提取了环境DNA（eDNA），并使用E.Z.N.A.? Mag-Bind? Environmental DNA 96 Kit（Omega Bio-tek）按照制造商的协议进行。同时，我们还处理了PCR级水作为阴性对照。为了检测目标生物，我们使用了两组引物：16S rRNA（V3-V4区域）和18S rRNA（V4区域）。DNA扩增过程按照Schroeder等（2021）的方法进行，其中包括一个两步聚合酶链反应（PCR）过程，首先扩增目标区域，然后添加样本特定的索引和Illumina p5/p7尾部。扩增混合物和热循环参数的详细信息在补充材料（Appendix S2）中报告。所有反应均包括非模板对照（NTC）以确认无污染，并且也包括提取阴性对照（NCs）。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上可视化，然后使用Mag-Bind? TotalPure NGS（Omega Bio-tek）进行纯化。纯化后的文库被定量并准备进行高通量测序，使用Illumina Novaseq6000 2×250平台。

原始扩增读数在测序前和后使用FastQC（0.12.1）进行检查。通过fastp（Chen等，2018）去除测序接头、低质量碱基和通用的16S和18S PCR引物。高质量读数使用DADA2（1.26.0；Callahan等，2016）进行去噪处理，生成扩增子序列变异（ASV）表。分类分析在QIIME 2（2024.10.1；Bolyen等，2019）中进行，使用SILVA（138.2；Quast等，2012）或PR2（5.1.0；Guillou等，2012）参考数据库进行16S和18S数据的分类。对于细菌生物膜的16S ASV表，我们直接分析其结果，而对于18S ASV表，我们排除了原生动物和大型藻类，仅保留微型真核生物分类群。

为了分析固着大型底栖生物群落，我们在实验室中对实验板进行高分辨率拍照，并将其浸入海水中。随后，我们通过图像分析来识别固着生物并估算其覆盖度。我们使用了6×4子样方格在图像上叠加，并在每个子样方格上对分类群的相对丰度进行评估，评分范围从0（不存在）到4（完全覆盖）。子样方格的评分总和被表达为整个表面的百分比覆盖度（Guarnieri等，2009）。此外，我们还通过放大镜对实验板进行视觉检查，以辅助识别生物并整合图像中的数据。那些无法在物种层面识别的分类群被归入更高分类群或形态分类群。游动生物（如腹足类和自由生活环节动物）未被纳入分析。

在实验结束时（180天），我们通过刮取实验板上的固着生物并干燥至恒重（约72小时）来测定其总生物量。干燥后的样本在550°C的炉中燃烧4小时，然后称重，通过减重计算总生物量，并以每平方厘米的灰烬无干重（mg cm?2）表示。

为了分析数据，我们使用了Student t检验来测试生物毒理学实验中处理与对照之间的差异。在进行t检验之前，我们首先使用Shapiro-Wilk检验检查数据的正态性，并使用Cochran的C检验检查方差齐性。如果数据呈现异方差性或非正态分布，则使用Welch t检验或Mann-Whitney检验代替Student t检验。

对于微生物附着物的分子数据，我们进行了方差分析（ANOVA）来测试不同底质在α多样性（即观察到的ASV数量）上的差异。在进行ANOVA之前，我们验证了数据的正态性和方差齐性。在涉及固定因素的多因素比较中，我们使用了Student-Newman-Keuls（SNK）检验。分析设计包括三个因素：时间（Ti，两个水平：浸入后7天和45天，固定），地点（Si，三个水平：S1、S2和S3，随机且正交），以及底质（Su，三个水平：混凝土、混凝土+5%生物炭和混凝土+10%生物炭，固定且正交），每种因素组合有3个样本。我们使用距离基础的置换多元方差分析（PERMANOVA；Anderson，2001）来测试底质对微生物附着物群落结构的影响。分析基于完整的实验设计，使用Bray-Curtis差异在累计和标准化的ASV计数上进行，进行了5000次置换。在涉及固定因素的配对比较中，我们使用了PERMANOVA t检验和999次置换，以评估不同处理之间的差异。多元模式通过基于Bray-Curtis差异矩阵的主坐标分析（PCoA）进行可视化。多等级条形图用于展示不同地点、时间和底质下微生物附着物群落的组成。

对于固着大型底栖生物群落，我们进行了方差分析（ANOVA）来测试不同底质在α多样性（即分类群丰富度）上的差异。在进行ANOVA之前，我们验证了数据的正态性和方差齐性。在实验结束时（180天），我们还进行了方差分析来测试不同底质在总生物量上的差异。在这些分析中，我们考虑了地点和底质这两个因素。PERMANOVA用于测试底质对固着大型底栖生物群落结构的影响，基于完整的实验设计，使用Bray-Curtis差异在未变换数据上进行，进行了5000次置换。不同底质下固着生物群落的定殖模式在三个实验地点中的时间变化通过结合分析（CAP；Anderson和Willis，2003）进行可视化，基于Ti×Si×Su质心的距离矩阵。对分类群与两个结合轴之间的相关性进行计算，以确定哪些分类群对群落差异贡献最大。在所有地点，分类群在60天（以及S3地点在120天）时被主导为蓝藻垫、*Spirorbis* spp.、附着的水母虫类和海鞘类，而随着定殖的进行，大型藻类、双壳类、藤壶和单体海鞘类的丰度增加。在所有地点，分类群的多样性、总生物量和某些外来或潜在入侵物种（如*Balanus trigonus*和*Botryllus schlosseri*）的丰度均未因底质而发生显著变化，表明生物炭混凝土既不会干扰本地大型底栖生物群落的发展，也不会促进非本地物种的定殖。

微生物附着物的群落结构在三个底质之间没有显著差异，但时间与地点的交互作用显著，表明不同地点的微生物群落随时间变化而呈现不同的趋势。在S2和S3地点，微生物群落的ASV数量随时间显著增加，而在S1地点，微生物群落的多样性没有显著变化。这些结果表明，尽管生物炭的加入对微生物群落的组成没有显著影响，但其对不同地点的微生物群落发展具有一定的影响。这些变化可能是由于不同地点的环境因素、邻近底栖群落的结构和繁殖体的可用性差异所导致。

在本研究中，我们发现生物炭混凝土对海洋生物和底栖群落的结构没有显著影响，支持了生物炭混凝土在海洋环境中的生物相容性。这表明，生物炭混凝土可以作为传统混凝土的替代材料，用于海洋人工结构的建设，而不会对海洋生物造成显著的负面影响。此外，生物炭混凝土的加入对微生物附着物和大型底栖生物的定殖过程没有显著影响，进一步支持了其作为生态友好型材料的潜力。

然而，尽管生物炭混凝土在生态兼容性方面表现出色，其在海洋环境中的应用仍需进一步研究。不同剂量的生物炭和不同的水泥混合物应根据具体情况进行评估，并通过长期的现场试验确保其在海洋人工结构中的有效实施。未来的研究还可以探索不同类型的生物炭，以最大化其在不同废物来源中的应用潜力。同时，需要注意使用来自污泥或粪便等废料的生物炭可能带来的环境问题，因为这些来源的生物炭可能含有更高的污染物，限制其在某些应用场景中的使用。因此，根据最终材料的使用和部署情况，选择合适的生物炭类型可能是解决这一问题的可行方法。

在考虑生物炭混凝土的长期碳储存和封存潜力时，其在海洋环境中的应用可以显著减少建筑行业中的二氧化碳排放。考虑到高等级混凝土（如C40）的平均隐含碳约为362千克CO?每立方米，而混凝土的平均重量为2300千克每立方米，加入1%重量的生物炭（如本研究中使用的生物炭，其碳含量超过75%）可以带来63.3千克CO?当量每立方米的碳储存潜力，相当于隐含碳减少了约17%。这种碳储存效果在陆地建设中已被证实，而在海洋环境中，其应用可能提供一种更现实且更安全的碳封存方式，相比直接将海藻或其他有机物质倾倒至深海，生物炭混凝土的应用可以将碳封存在人工结构中，而不会对海洋生态系统造成显著影响。

综上所述，本研究的发现表明，生物炭混凝土在海洋环境中的应用是可行的，并且可以作为传统混凝土的生态友好型替代材料。其加入不会对海洋生物和底栖群落造成显著的生态影响，同时能够提高混凝土的碳储存能力，从而有助于减少建筑行业的碳排放。未来的研究应进一步评估不同剂量的生物炭对海洋生物群落的长期影响，并探索其在不同海洋环境中的应用潜力。此外，还需要关注生物炭的来源和污染水平，以确保其在海洋结构中的安全使用。生物炭混凝土的应用不仅有助于减少建筑行业的碳足迹，还可以为海洋和沿海基础设施的可持续发展提供新的思路。