从大枣中提取的一种多糖的纯化及其结构特性研究，旨在缓解炎症引起的贫血

《Journal of Future Foods》：Purification and structural characterization of a polysaccharide from jujube for alleviating anemia of inflammation

炎症性贫血的枣多糖JP0-a调控IL-6/STAT3/Hepcidin轴的机制研究。从枣中提取并纯化中性多糖JP0-a，其分子量为1.98×10^6 Da，主要含葡萄糖通过→3)-Glcp-(1→连接。通过细胞实验和动物模型证实JP0-a通过抑制IL-6表达、磷酸化STAT3及降低Hepcidin水平，改善贫血相关铁代谢紊乱和炎症反应。首次阐明枣多糖抗炎性贫血的分子机制，为功能食品开发提供新依据。

　　### 酥蜜枣多糖JP0-a对炎症性贫血的潜在治疗作用研究

#### 引言

近年来，随着对天然活性成分研究的不断深入，植物多糖因其丰富的生物活性和良好的安全性，逐渐成为功能性食品和药物开发的重要资源。其中，枣（Ziziphus jujuba）作为一种传统中药材，不仅具有良好的营养成分，还因其丰富的多糖、黄酮类化合物和酚酸类物质，展现出多种生物活性，包括补血、安神、改善睡眠、健脾养胃等。在现代医学研究中，枣多糖被证实具有抗炎、抗肿瘤、抗疲劳和调节肠道菌群等作用，为开发相关疾病治疗药物提供了基础。此外，枣多糖因其良好的生物相容性，也被广泛应用于生物材料的制备，如药物载体和伤口修复材料。然而，尽管枣多糖的研究已取得一定进展，其在炎症性贫血（Anemia of Inflammation, AI）中的具体作用机制仍不明确。

炎症性贫血是一种常见的临床病症，常出现在住院或慢性疾病患者中，如感染、充血性心力衰竭、慢性肾病和癌症等。其主要症状包括头晕、乏力、心悸、失眠和食欲减退等。AI的发病机制涉及hepcidin表达紊乱和促红细胞生成素（EPO）合成障碍，而hepcidin作为铁代谢的中心调控因子，通过抑制铁吸收和分布，导致体内铁元素无法正常释放至血液，从而影响红细胞生成和血红蛋白合成。在炎症状态下，hepcidin的表达主要通过IL-6/STAT3信号通路调控，因此，靶向这一通路成为缓解AI的有效策略之一。尽管已有多种hepcidin靶向治疗药物被开发出来，如hepcidin拮抗剂（LY2787106、NOX-H94）和上游调控通路的调节剂（LDN-193189），但其临床转化仍面临诸多挑战，如药代动力学不佳、肝肾毒性风险、非特异性脱靶效应、免疫原性和高昂成本等。

在此背景下，寻找具有针对性调节hepcidin能力的天然活性成分成为研究热点。已有研究表明，枣多糖可通过双机制缓解慢性肾病（CKD）引发的AI，即上调EPO表达和增强短链脂肪酸（SCFA）的合成。这一发现进一步表明，枣多糖在改善AI方面具有广阔的应用前景。然而，是否枣多糖能够通过调节hepcidin表达来缓解AI，尚缺乏直接证据。因此，本研究旨在从枣中分离和纯化一种具有hepcidin调节作用的中性多糖，并系统研究其结构特征、理化性质及其对AI的潜在治疗效果，为枣多糖作为功能性食品和膳食补充剂的应用奠定理论基础。

#### 材料与方法

**材料与试剂**

本研究使用的枣样品购自北京同仁堂公司（北京，中国）。HepG2细胞株（BFN60800692）购自上海生化细胞生物学研究所（上海，中国）。Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、青霉素-链霉素和胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国纽约）。DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100柱购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。单糖标准品、血清铁检测试剂盒、组织铁检测试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（北京，中国）。小鼠hepcidin ELISA试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司（上海，中国）。乙醇、硫酸及其他试剂购自上海化学试剂公司（上海，中国）。

**枣多糖的提取与纯化**

按照前人的方法并进行适当改进，从枣中提取和纯化多糖。具体流程包括：用蒸馏水去除枣表面杂质，去核、干燥（40°C）和粉碎处理后，使用石油醚和乙醇（1:1）混合液进行脱脂处理。随后，采用热水提取法（80°C，3小时，固液比1:10，共提取三次），过滤去除不溶性物质后，收集滤液并浓缩至一定体积。接着，加入无水乙醇使最终浓度达到80%，静置沉淀（4°C，12小时）后离心（4°C，8000 rpm，30分钟）收集沉淀物。通过Sevage试剂和活性炭去除蛋白质和色素，最后经透析（8000 Da～12000 Da，48小时）和冷冻干燥获得粗多糖。随后，将粗多糖溶解于蒸馏水中并过滤（0.45 μm），上样于DEAE-52纤维素柱（1.6 cm × 60 cm），以0、0.1、0.2和0.3 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，自动收集洗脱液并用酚-硫酸法监测相同成分。最终获得三个成分，分别命名为JP0、JP1和JP2。其中，JP0为中性多糖，而JP1和JP2为酸性多糖。为了进一步纯化JP0，采用Sephadex G-100柱（1.6 cm × 60 cm），使用蒸馏水作为洗脱液（0.8 mL/min），洗脱液经浓缩、透析和冷冻干燥后，获得白色固体多糖JP0-a。

**化学成分分析**

采用酚-硫酸法测定JP0-a的总糖含量，采用BCA法测定蛋白质含量。尿糖酸含量和总酚含量分别采用尿糖酸咔唑法和Folin-Ciocalteu法进行分析。利用紫外可见分光光度计（UV-2600，日本岛津）检测JP0-a中蛋白质和核酸的存在，其检测范围为200至400 nm。

**分子量测定**

采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定JP0-a的分子量，使用1-5000 kDa的葡聚糖标准品绘制标准曲线。根据保留时间计算JP0-a的分子量，其结果为1.98×10? Da。同时，测定其多分散指数（Mw/Mn）为1.248，表明其具有较高的均一性。此外，JP0-a的分子量较高，与从其他植物中提取的多糖（如Pleurotus citrinopileatus和Gastrodia elata）相似，这为其在体内发挥良好生物活性提供了结构基础。

**单糖组成分析**

采用PMP衍生化-高效液相色谱法（HPLC）测定JP0-a的单糖组成。将10 mg JP0-a在2 M三氟乙酸中水解（5 mL，110°C，2小时），随后进行PMP衍生化处理。通过HPLC（LC-20A，日本岛津）分析衍生化后的溶液，使用10 μL进行检测。结果表明，JP0-a主要由葡萄糖组成，且其单糖组成与已知的枣多糖类似。

**结构表征**

**傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析**

采用FT-IR光谱仪（Nicolet 6700，Thermo Scientific，美国）检测JP0-a的特征吸收峰。将2 mg JP0-a与150 mg KBr粉末混合后，在研钵中研磨，并压制成片进行检测，波数范围为4000-400 cm?1。结果显示，JP0-a在3442.93 cm?1处有宽吸收峰，对应O–H伸缩振动；在2922.15和1419.6 cm?1处有吸收峰，分别对应C–H伸缩和弯曲振动；在1649.13 cm?1处有明显的C=O伸缩振动；在1200-1000 cm?1范围内有吸收峰，对应于吡喃糖环的C–O–C和C–O–H伸缩振动。此外，在914.25和860.25 cm?1处有吸收峰，分别对应β-和α-糖苷键。

**甲基化分析**

采用前人方法进行适当修改，对JP0-a的糖苷键类型进行分析。将5.0 mg真空干燥的JP0-a（80°C，2小时）进行水解、还原和乙酰化预处理，随后采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行分析。GC-MS条件为：HP-INNOWAX柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），初始温度140°C，升温速率1°C/min，最终温度230°C；进样口温度250°C，检测器温度250°C，载气为氦气，流速为1 mL/min。结果显示，JP0-a含有7种糖苷键类型，其中→3)-Glcp-(1→为主要糖苷键类型，占比67.3%。

**考马斯亮蓝实验**

采用前人方法进行适当修改，对JP0-a的结构进行进一步分析。将1 mL JP0-a（1 mg/mL）与等体积的考马斯亮蓝（50 μM）混合，随后逐步加入1 M NaOH至最终浓度为0.8 M，检测200-600 nm范围内的吸收光谱。结果显示，JP0-a与考马斯亮蓝形成的复合物在NaOH浓度梯度下吸收逐渐减少，且无明显红移现象，表明其结构为非三螺旋结构。

**理化性质分析**

**扫描电子显微镜（SEM）分析**

采用扫描电子显微镜（S-4700，日立，日本）观察JP0-a的微观形态和结构。加速电压为20 kV，放大倍数为1000×和2000×。JP0-a主要呈现不规则球形和片状结构，部分区域可见纤维状结构。在2000×放大倍数下，观察到较为松散的层状结构。该结构与之前报道的Imperata cylindrica多糖相似，可能由于多糖与电荷相互作用导致紧密的片状结构。

**原子力显微镜（AFM）分析**

采用原子力显微镜（Bioscope Catalyst，Bruker，美国）观察JP0-a的微观结构。将1 mg JP0-a溶解于蒸馏水中并依次稀释至10 μg/mL，经0.22 μm滤膜过滤后，将5 μL样品滴加至新切的云母表面，干燥（25°C，24小时）后进行观察。AFM图像显示，JP0-a呈现不同大小的球形和不规则的穹顶状颗粒，这与其分支和纠缠结构有关。3D成像显示JP0-a的高度为7.0 nm，表明链间的范德华力促进了分子的组装，形成聚集体网络。对于多糖分子，较高的聚合度有助于其在体内发挥更好的生物活性。

**X射线衍射（XRD）分析**

采用X射线衍射仪（Ultima IV，Rigaku，日本）对JP0-a的晶体结构进行检测。按照前人方法，将适量JP0-a样品置于样品架上，采用标准扫描参数：铜靶，管压40 kV，扫描速度5°/min，扫描范围3°-90°。结果显示，JP0-a在10°至90°范围内呈现低结晶度，单峰中心位于2θ=18.48°，表明其为非晶态结构。

**热重分析（TGA）**

采用热重分析仪（STA449F5，Netzsch，德国）检测JP0-a的热稳定性。将5 mg JP0-a置于铂坩埚中，升温范围为40°C-500°C，升温速率为10°C/min，载气为氮气（20 mL/min）。结果显示，JP0-a的热失重分为三个阶段，其中第一阶段（50°C-130°C）失重7.68%，归因于水分蒸发；第二阶段（220°C-380°C）失重76.83%，是其最大分解或解聚阶段；第三阶段（400°C-800°C）失重较少，表明其具有良好的热稳定性，为食品加工中的高温处理提供了保障。

#### 结果

**枣多糖的提取、分离与纯化**

通过热水提取、乙醇沉淀、脱蛋白和脱色处理，获得粗多糖。随后，采用DEAE-52纤维素柱进行纯化。结果显示，粗多糖分为三个成分（JP0、JP1、JP2），其中JP0的纯度为2.23%，JP1为0.63%，JP2为0.84%。JP0为中性多糖，而JP1和JP2为酸性多糖。在HepG2细胞中，JP0对hepcidin mRNA表达的抑制作用最强，其抑制率在200 μg/mL时达到63.06%（p<0.001），显著高于JP1（40.68%）和JP2（33.01%）。因此，JP0被选为后续纯化对象。通过Sephadex G-100柱纯化后，获得单一峰，表明其具有均匀的分子量分布。经冷冻干燥后，获得白色多糖JP0-a。

**化学成分分析**

化学成分分析显示，JP0-a具有高纯度（98.86%）和低蛋白含量（0.26%）。此外，未检测到尿糖酸和酚类物质。紫外扫描光谱（图3B）显示，JP0-a在260 nm和280 nm处无吸收峰，表明蛋白质和核酸已被有效去除，进一步验证了纯化效果。

**分子量测定**

通过HPGPC测定JP0-a的分子量，结果显示其分子量为1.98×10? Da，多分散指数（Mw/Mn）为1.248，表明其具有较高的均一性。此外，JP0-a的分子量较高，与从其他植物中提取的多糖（如Pleurotus citrinopileatus和Gastrodia elata）相似，这为其在体内发挥良好生物活性提供了结构基础。高分子量可能有助于其与细胞受体形成更有效的生物活性构象，从而增强其抗酶解能力，提高生物利用度。

**单糖组成分析**

HPLC图谱（图3D）显示，JP0-a主要由葡萄糖组成，未检测到其他单糖。这表明其为一种纯葡萄糖多糖（glucan），与之前报道的其他枣多糖不同。此外，JP0-a的单糖组成与Imperata cylindrica和Wolffporia cocos多糖相似，可能具有相似的生物活性。

**结构表征**

**FT-IR分析**

FT-IR光谱（图4A）显示，JP0-a在3500-3300 cm?1、3000-2800 cm?1、1700-1200 cm?1和1100-500 cm?1范围内有特征吸收峰。3442.93 cm?1处的宽吸收峰对应O–H伸缩振动；2922.15和1419.6 cm?1处的吸收峰分别对应C–H伸缩和弯曲振动；1649.13 cm?1处的吸收峰对应C=O伸缩振动；1200-1000 cm?1范围内的吸收峰源于吡喃糖环中的C–O–C和C–O–H伸缩振动，表明其结构中存在这些基团。此外，914.25和860.25 cm?1处的吸收峰分别对应β-和α-糖苷键，进一步验证了其结构特征。这些特征与之前报道的多糖一致，表明其具有良好的结构基础。

**甲基化分析**

甲基化分析（表1）显示，JP0-a含有7种糖苷键类型，其中→3)-Glcp-(1→为主要糖苷键类型，占比67.3%。该结果与单糖组成分析一致，表明JP0-a主要由葡萄糖单元组成，且其糖苷键类型多样。

**考马斯亮蓝实验**

考马斯亮蓝实验（图4B）显示，JP0-a与考马斯亮蓝形成的复合物在NaOH浓度梯度下吸收逐渐减少，且无明显红移现象，表明其结构为非三螺旋结构。

**微观结构分析**

**扫描电子显微镜（SEM）分析**

SEM图像（图5A）显示，JP0-a在1000×和2000×放大倍数下呈现不规则球形和片状结构，部分区域可见纤维状结构。在2000×放大倍数下，观察到较为松散的层状结构。该结构与之前报道的Imperata cylindrica多糖相似，可能由于多糖与电荷相互作用导致紧密的片状结构。

**原子力显微镜（AFM）分析**

AFM图像（图5B）显示，JP0-a呈现不同大小的球形和不规则的穹顶状颗粒，这与其分支和纠缠结构有关。3D成像显示JP0-a的高度为7.0 nm，表明链间的范德华力促进了分子的组装，形成聚集体网络。较高的聚合度有助于其在体内发挥更好的生物活性。

**X射线衍射（XRD）分析**

XRD图谱（图5D）显示，JP0-a在10°至90°范围内呈现低结晶度，单峰中心位于2θ=18.48°，表明其为非晶态结构。

**热重分析（TGA）**

TGA曲线（图5C）显示，JP0-a的热失重分为三个阶段。第一阶段（50°C-130°C）失重7.68%，归因于水分蒸发；第二阶段（220°C-380°C）失重76.83%，是其最大分解或解聚阶段；第三阶段（400°C-800°C）失重较少，表明其具有良好的热稳定性。这一特性使其在食品加工过程中（如高温灭菌和喷雾干燥）能够保持其生物活性构象，为作为热敏性营养物质的载体提供了可能。

**JP0-a对LPS诱导HepG2细胞中hepcidin表达的影响**

采用MTT法评估JP0-a对HepG2细胞的细胞毒性。结果显示，不同浓度的JP0-a对细胞无明显毒性，且在一定范围内，细胞活力随浓度增加而升高，最高可达156%（200 μg/mL，p<0.001）。因此，选择20、100和200 μg/mL作为后续实验的剂量。进一步研究显示，JP0-a能够剂量依赖性地降低hepcidin mRNA表达，尤其在200 μg/mL时，其抑制率高达75.60%（p<0.001），与LPS单独处理组相比显著降低。此外，JP0-a还能够剂量依赖性地降低IL-6 mRNA表达，最高抑制率为79.34%（200 μg/mL，p<0.001）。在LPS处理组中，hepcidin和磷酸化STAT3蛋白水平分别升高79.34%（p<0.01）和123.61%（p<0.01），而JP0-a处理组则显著降低。这一结果表明，JP0-a能够通过抑制IL-6/STAT3信号通路，从而降低hepcidin表达。

**JP0-a对AI小鼠的影响**

为了进一步验证JP0-a对AI的治疗效果，建立了AI小鼠模型。将30只雄性BALB/c小鼠（6周龄，20 ± 2 g）随机分为5组：正常对照组（Control）、模型组（Model）、低剂量组（Low，50 mg/kg）、中剂量组（Middle，100 mg/kg）和高剂量组（High，200 mg/kg）。模型组小鼠每周注射5 ml/kg的亚麻油一次，共注射三次，以建立AI模型。正常对照组小鼠则接受无菌生理盐水处理。注射结束后，各组小鼠分别接受不同剂量的JP0-a处理，持续两周。处理结束后，通过心脏穿刺收集血清，并分离肝脾组织样本，保存于-80°C冰箱中。

**全血细胞计数**

采用全自动血细胞分析仪（BC-60R Vet，Sysmex，日本）检测小鼠外周血的全血细胞计数。结果显示，模型组小鼠的红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB）水平分别降低30.02%（p<0.05）和27.47%（p<0.01），符合临床贫血标准。这为AI模型的建立提供了有力证据。JP0-a处理后，各组小鼠的RBC和HGB水平显著恢复，其中高剂量组小鼠的RBC和HGB水平分别恢复36.60%（p<0.05）和23.94%（p<0.05）。同时，模型组小鼠的白细胞（WBC）水平显著升高，达到262.39%（p<0.001），与已知的炎症阈值一致。JP0-a处理后，WBC水平显著降低，其中高剂量组小鼠的WBC水平降低47.09%（p<0.05），表明其具有良好的抗炎效果。此外，模型组小鼠的血清hepcidin和IL-6水平显著升高，分别达到26.9583 ng/mL和62.884 pg/mL（p<0.001）。JP0-a处理后，血清hepcidin和IL-6水平显著降低，其中高剂量组小鼠的hepcidin水平降低至16.125 ng/mL（p<0.05），IL-6水平降低至26.26%（p<0.01）。这些结果与体外实验结果一致，进一步验证了JP0-a对hepcidin表达的调节作用。

**肝脾铁含量检测**

采用组织破碎机将肝脾组织样本破碎为组织匀浆，随后离心（4°C，1200 rpm，10分钟）收集上清液，并按照制造商的协议进行分析。结果显示，模型组小鼠的肝脾铁含量显著升高，肝铁含量从76.224 μg/g增加至169.252 μg/g（p<0.001），脾铁含量从150.676 μg/g增加至315.17 μg/g（p<0.001），表明AI导致了肝脾中的铁沉积。JP0-a处理后，肝脾铁含量显著降低，其中高剂量组小鼠的肝铁含量降低29.29%（p<0.01），脾铁含量降低37.37%（p<0.001），表明其能够有效缓解AI引起的铁沉积，并促进铁从肝脾释放至血清，参与多种生理活动。

#### 讨论

植物多糖的生物活性与其化学结构密切相关。因此，结构分析是其高价值应用的前提。多糖的理化性质，如溶解性、热稳定性和免疫调节能力，均受到其分子量、单糖组成和糖苷键类型的影响。分子量较高的多糖通常具有更好的生物活性，这可能是因为高分子量多糖更容易与细胞受体形成有效的生物活性构象。此外，单糖组成不同的多糖可能具有不同的生物活性基础。例如，葡萄糖多糖已被证明具有抗炎、抗抑郁和抗衰老等作用。糖苷键类型则决定了分子构象和空间结构，从而影响其生物功能。值得注意的是，富含→3)-Glcp-(1→糖苷键的多糖已被证实具有多种有益效果，如抗炎、抗肿瘤和抗衰老等。

在本研究中，JP0-a被鉴定为一种高分子量（1.98×10? Da）的中性多糖，主要由葡萄糖组成，且其糖苷键类型多样，其中→3)-Glcp-(1→为主要类型，占比67.3%。此外，其非晶态结构和良好的热稳定性为体内吸收和生物活性提供了结构基础。在体外实验中，JP0-a能够显著降低LPS诱导的HepG2细胞中hepcidin的表达，其机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。而在体内实验中，JP0-a同样能够降低血清中hepcidin和IL-6的水平，进一步验证了其对hepcidin表达的调节作用。

此外，JP0-a的非晶态结构可能与其良好的溶解性和生物可及性有关，这为其在体内的有效吸收和生物活性提供了结构基础。其优异的热稳定性则确保了其在食品加工过程中的保留，使其在高温灭菌和喷雾干燥过程中仍能保持生物活性构象，从而作为热敏性营养物质的载体具有潜在应用价值。这些研究结果表明，JP0-a在缓解AI方面具有广阔的应用前景。

#### 结论

本研究从枣中分离和纯化出一种均质的中性多糖JP0-a，其分子量为1.98×10? Da，主要由葡萄糖组成，且其糖苷键类型多样，其中→3)-Glcp-(1→为主要类型。通过SEM、AFM和TGA分析，确认其具有紧密的结构和良好的热稳定性。在LPS诱导的HepG2炎症细胞中，JP0-a能够通过靶向IL-6/STAT3信号通路，显著降低hepcidin的表达。此外，在AI小鼠模型中，JP0-a能够改善小鼠的生理指标，表明其在缓解AI方面具有潜在价值。综上所述，本研究丰富了枣多糖的种类，为开发以枣多糖为基础的膳食补充剂和功能性食品提供了理论依据，并强调了从传统食品中探索生物活性成分在科学基础上应对健康挑战的重要性。