利用4F肽高分辨率解析真核膜蛋白结构：一种去垢剂替代方案及其在结构生物学中的突破

本研究提出了一种创新的无去垢剂膜蛋白 solubilization 方法，通过4F肽将真核膜蛋白有效包裹于纳米盘（4F-discs）中，显著提升冷冻电镜（cryo-EM）结构解析的分辨率与准确性，为膜蛋白功能机制研究提供重要技术支撑。

　　

亮点

• 4F肽可高效 solubilize 真核膜蛋白并形成结构均一的纳米盘（4F-discs）

• 该方法避免了传统去垢剂对天然脂质环境的破坏，保留蛋白功能性

• 成功解析人源TRPC3离子通道高分辨率结构（cryo-EM）

• 技术普适性验证：适用于氧化酶（DUOX1-DUOXA1、NOX2-p22^phox）及转运蛋白（URAT1、NTCP）

讨论

本研究开发了一种基于4F肽的真核膜蛋白 solubilization 策略，有效规避了传统去垢剂法的局限性。实验证明4F肽能 solubilize 多种关键膜蛋白（包括离子通道hTRPC3、膜整合氧化酶DUOX1-DUOXA1与NOX2-p22^phox、转运蛋白URAT1和NTCP），并维持其结构完整性与功能性。通过将4F-discs转化为MSP包裹的纳米盘，可进一步提升样品均一性，支持高分辨率结构解析。该技术为膜蛋白研究提供了更贴近天然状态的实验体系。

材料与方法

细胞培养

Sf9昆虫细胞（Thermo Fisher Scientific）于27°C在SIM SF无血清培养基（Sino Biological）中培养。FreeStyle 293F悬浮细胞（Thermo Fisher Scientific）在含1%胎牛血清（FBS, VisTech）、67 μg/mL青霉素（Macklin）及139 μg/mL链霉素（Macklin）的FreeStyle 293培养基中，于37°C、6% CO₂和70%湿度条件下培养。细胞系经定期检测确认为支原体阴性。

冷冻电镜数据收集

网格初筛在Talos Arctica电镜（Thermo Fisher Scientific，200 kV）搭配K2相机（Thermo Fisher Scientific）完成。高清数据在300 kV Titan Krios（Thermo Fisher）上采集，使用K2 Summit直接电子相机（Thermo Fisher Scientific）和20 eV狭缝宽度能量过滤器，放大倍数60,000×，像素尺寸0.834 ?，散焦范围-1.5至-1.8 μm。超分辨率影片（32帧/曝光）以10 e^?/?²/s的电子剂量率采集，总曝光时间6秒。

模型构建、优化与验证

hTRPC3模型基于已发表结构7DXB在Coot[52]中手动搭建，并通过PHENIX[53]进行优化。

量化与统计分析

数据处理与统计分析使用GraphPad Prism完成。统计细节详见方法说明与图注。冷冻电镜密度图全局分辨率基于0.143傅里叶壳相关准则[54]估算，局部分辨率通过cryoSPARC计算。独立实验次数（N）及相关统计参数（如均值、标准差）均于对应图表中注明。