IL-21依赖性Ly6C+Ly6G+CD4+ T细胞通过增强巨噬细胞功能防御胸膜肺炎放线杆菌感染

本研究针对细菌性肺炎防治中免疫机制不清的问题，通过构建IL-21R基因敲除小鼠模型，结合高维质谱流式细胞术和转录组分析，首次发现IL-21诱导的Ly6C+Ly6G+CD4+ T细胞新亚群能通过调控巨噬细胞极化（M1/M2表型转换）并增强其吞噬杀菌功能（METs/ROS机制），为细菌性肺炎的免疫治疗提供了新靶点。

　　

肺炎作为一种严重的肺部感染性疾病，每年导致全球数万人死亡，对人类和动物健康构成重大威胁。尽管疫苗和抗生素仍是当前主要的预防和治疗手段，但抗生素耐药性的加剧和广谱疫苗的缺乏，迫使科学家们不得不寻找新的替代疗法。近年来，随着单细胞技术的飞速发展，科学家们在肺部发现了多个具有重要免疫调节功能的免疫细胞亚群，甚至有些已经进入临床应用阶段。例如，sB-1a B细胞通过分泌高亲和力IgM来提供对抗肺炎链球菌肺炎的保护，并通过产生IL-10、IL-35等抗炎因子来减轻肺部炎症，这些细胞现已被认为是治疗细菌性和病毒性肺炎（包括COVID-19）的靶点。

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是引起猪胸膜肺炎的病原体，这是一种高度传染性和致死性的猪肺部疾病，对养猪业构成重要威胁。APP对肺部有强烈的趋向性，因此常被用来制作实验性肺炎模型。APP感染的小鼠表现出与猪相似的肺部病理变化，使其成为肺炎研究和药物评估的重要工具。

IL-21主要由CD4⁺ T和NKT细胞产生，通过广泛表达于淋巴细胞、髓系细胞和上皮细胞的IL-21R发挥广泛的免疫调节作用。先前的研究发现，在APP感染的小猪支气管肺泡灌洗液中，IL-21在感染后24小时显著增加，但在血清中却没有，这表明其在肺部免疫中具有局部作用。然而，IL-21在急性细菌性肺炎期间对肺部免疫反应的影响仍知之甚少。

为了研究IL-21/IL-21R信号在细菌性肺炎中的作用，研究人员使用APP作为模型细菌，在野生型（WT）和IL-21R敲除（IL-21R^-/-）小鼠中建立了急性肺部感染模型，并应用质谱流式细胞术和流式细胞术探索了IL-21/IL-21R在APP感染中的作用。借助高通量质谱流式细胞术，分析了IL-21/IL-21R信号对肺部免疫细胞组成和功能的影响，以确定关键免疫亚群在APP诱导的肺炎中的机制和作用。

研究发现，IL-21/IL-21R信号通过促进早期炎症反应增强了对APP的肺部防御。此外，一个先前未知的CD4⁺ T细胞亚群，其表面表达Ly6C和Ly6G，具有强大的分泌IL-10、IL-21、穿孔素和颗粒酶B的能力，且依赖于IL-21，仅在APP、肺炎克雷伯菌或大肠杆菌感染的WT小鼠肺部出现。更重要的是，这些细胞促进了巨噬细胞的增殖，在感染后将巨噬细胞从M2表型极化为M1表型，并增强了巨噬细胞对APP、肺炎克雷伯菌或大肠杆菌感染的吞噬和杀菌功能（巨噬细胞胞外陷阱METs或活性氧ROS介导），从而有助于宿主防御细菌感染。因此，该研究为建立基于宿主免疫反应的新型肺炎预防和治疗方法奠定了基础。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用IL-21R基因敲除小鼠模型进行体内感染实验；通过高通量质谱流式细胞术（CyTOF）对肺部免疫细胞进行高维表型分析；利用流式细胞术进行细胞分选和细胞内细胞因子检测；采用RNA测序技术对特定T细胞亚群进行转录组分析；通过体外细胞共培养系统评估免疫细胞互作功能；使用ELISA和荧光检测技术定量细胞因子及代谢产物（如ROS、dsDNA）。

IL-21/IL-21R对小鼠防御APP感染至关重要

通过生存率、临床评分、体重变化、肺指数和肺部病理学检查发现，IL-21R^-/-小鼠对APP感染更敏感，表现为更严重的临床症状和肺部损伤。预先给予IL-21能显著减轻感染症状和肺部细菌负荷，证实IL-21/IL-21R信号在小鼠防御APP感染中起关键作用。

质谱流式分析揭示APP感染后小鼠肺部IL-21诱导的独特髓系细胞谱

通过高维质谱流式细胞术分析了WT和IL-21R^-/-小鼠感染APP后肺部免疫细胞组成的差异，鉴定出37个表型 distinct 的髓系细胞簇，归为14个主要细胞群体，包括中性粒细胞、炎症单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。IL-21R缺失抑制了中性粒细胞的活化，减少了单核细胞和促炎巨噬细胞的数量，并促进了肺部缺陷型CD3^low T细胞的积累。

IL-21R缺失导致肺部促炎细胞因子表达不足

RT-qPCR和流式细胞术检测发现，IL-21R^-/-小鼠感染APP后，肺部细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6）的产生减少，尤其是在CD8⁺ T细胞中。IL-21R缺失还降低了CD8⁺ T细胞、中性粒细胞和单核细胞中IL-17A的产生，但未影响CD4⁺ T细胞群体中IL-17A的产生。

IL-21/IL-21R信号塑造了未被识别的Ly6C⁺Ly6G⁺ T细胞的组成并减少了小鼠肺部缺陷型CD3^low T细胞

对CD4⁺ T细胞区室的分析发现，IL-21R缺失导致Ly6C和Ly6G双阳性的CD4⁺ T细胞亚群显著减少，这些细胞主要是中央记忆T细胞（T_cm）。类似地，在CD8⁺ T细胞区室中也发现了Ly6C和Ly6G双阳性的细胞亚群，且其在IL-21R缺陷小鼠中的比例也显著减少。此外，IL-21R缺陷小鼠肺部大部分CD8⁺ T细胞为TCRβ^lowCD3ε^low表型，而WT小鼠的CD8⁺ T细胞为TCRβ⁺CD3ε⁺表型。

Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞处于活化状态，具有更强的IL-10、IL-21、穿孔素和颗粒酶B分泌能力

转录组分析显示，与Ly6C⁺Ly6G^-CD4⁺ T细胞相比，Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞高表达Mmp9、Ccl3、Ccl4、Cxcl2、Cxcl3、Nlrp3和Il1a等基因，且富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。流式细胞术检测发现，Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞分泌IL-10、IL-21、颗粒酶B和穿孔素的能力显著高于其他亚群。此外，这些细胞中的IL-21⁺颗粒酶B⁺细胞为CXCR5⁺细胞，表明Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞包括细胞毒性T滤泡辅助细胞（T_fh）。

Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞在APP感染后促进巨噬细胞从M2向M1表型极化

将Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞与RAW264.7巨噬细胞共培养发现，该细胞能显著促进巨噬细胞增殖，并增强M2极化相关分子精氨酸酶I和IL-18的分泌。在APP感染后，IL-21补充组和Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞共培养组中M1型巨噬细胞（CD86⁺）的比例增加，而CD206⁺ M2型巨噬细胞的比例减少。此外，感染后IL-21或Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞共培养组对TNF-α分泌的抑制减弱，表明IL-21在感染后可能诱导TNF-α产生。

Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞通过METs或ROS增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力

研究发现，与Ly6C⁺Ly6G^-CD4⁺ T细胞共培养组和巨噬细胞单独组相比，Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞共培养组巨噬细胞吞噬APP、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的数量显著增加。此外，在APP感染后，Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞共培养组巨噬细胞产生dsDNA的能力显著增强，表明其通过METs增强杀菌活性。在大肠杆菌或肺炎克雷伯菌感染后，IL-21补充组和T细胞共培养组均能增强巨噬细胞ROS的释放。

CD14⁺CD4⁺ T细胞通过METs或ROS促进猪肺泡巨噬细胞杀菌

由于猪缺乏Ly6G和Ly6C分子，研究发现CD14在Ly6C⁺Ly6G⁺CD4⁺ T细胞中的表达显著高于Ly6C⁺Ly6G^-CD4⁺ T细胞，且APP感染后猪肺部CD14⁺CD4⁺ T细胞的比例增加。将CD14⁺CD4⁺ T细胞与猪肺泡巨噬细胞（PAMs）共培养发现，该细胞能促进PAMs产生ROS和更高水平的dsDNA，从而增强其杀菌能力。

本研究首次揭示了IL-21/IL-21R信号在细菌性肺炎中的保护作用，其通过促进早期先天免疫反应、增强关键免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）的活化和分化，并抑制缺陷型CD3^low T细胞的积累来实现。更重要的是，研究发现了一个先前未被认识的IL-21诱导的Ly6C⁺Ly6G⁺ T细胞亚群，该亚群具有强大的细胞因子分泌能力，并能通过调控巨噬细胞极化和功能（如吞噬、METs/ROS介导的杀菌）来增强宿主对细菌感染的防御。这一发现不仅拓宽了对T细胞功能的认识，还为细菌性肺炎的药物和疫苗开发提供了新的靶点。尽管小鼠模型为机制研究提供了宝贵且易于操作的工具，但免疫反应可能与APP的自然宿主猪有所不同，这一局限性在将研究结果转化为临床应用时应予以考虑。