奈非那韦通过内质网应激诱导GPX4/GSH系统下调、NRF2/HO-1轴激活和线粒体功能障碍触发肝细胞癌铁死亡的新型机制研究

本研究针对肝细胞癌(HCC)治疗需求，探索HIV蛋白酶抑制剂奈非那韦(Nelfinavir)诱导铁死亡(Ferroptosis)的新机制。研究人员发现奈非那韦通过激活内质网应激(ER stress)，下调GPX4/GSH系统，上调NRF2/HO-1轴，导致线粒体损伤和脂质过氧化，显著抑制肝癌细胞生长。与索拉非尼(Sorafenib)联用展现协同效应，为肝癌治疗提供新的联合策略。

　　

在肝癌治疗领域，寻找有效的新型治疗策略一直是研究人员面临的重大挑战。肝细胞癌(HCC)作为最常见的肝脏恶性肿瘤，占原发性肝癌的75-85%，其晚期诊断、治疗抵抗和肝功能障碍等特点导致患者预后极差。虽然多激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib)已成为晚期HCC的一线治疗药物，但疗效有限，迫切需要开发新的治疗方法和联合策略。

近年来，铁死亡(Ferroptosis)作为一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式，在肿瘤治疗领域展现出巨大潜力。这种细胞死亡形式由含多不饱和脂肪酸的磷脂氧化介导的膜损伤执行，具有独特的作用机制。多种常规癌症治疗方法，包括放疗、靶向治疗、化疗和免疫治疗，其抗肿瘤效应都部分通过铁死亡介导。更重要的是，铁死亡诱导剂能够增强传统疗法的疗效，并克服靶向治疗耐药性。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，Lei Zhang和Xuejun Wang研究团队发现人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂奈非那韦(Nelfinavir)能够作为一种新型铁死亡诱导剂，在肝细胞癌细胞中发挥显著抗肿瘤效果。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究：通过CCK-8法和PI染色检测细胞死亡；使用C11-BODIPY荧光探针和MDA测定法量化脂质过氧化水平；蛋白质印迹分析(Western blot)检测关键蛋白表达；自噬流实验评估自噬活性；CHX蛋白追踪实验分析蛋白稳定性；GSH/GSSG检测试剂盒测量谷胱甘肽水平；JC-1和MitoSOX染色分别评估线粒体膜电位和超氧化物产生；FerroOrange检测细胞内Fe²⁺水平；并利用BALB/c裸鼠异种移植模型进行体内实验验证。

Nelfinavir促进HCC细胞系铁死亡

研究人员首先验证了奈非那韦在Hepa1-6和HepG2两种肝癌细胞系中的细胞毒性作用。剂量依赖性实验显示，奈非那韦显著增加细胞死亡，40μM浓度处理48小时后，约60-75%的细胞死亡可被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)挽救。通过C11-BODIPY荧光探针和MDA浓度测定，证实奈非那韦诱导了明显的脂质过氧化。

Nelfinavir下调GPX4-GSH系统

研究发现奈非那韦剂量依赖性地显著降低System Xc-转运亚基SLC7A11、GPX4和铁存储蛋白铁蛋白(FTH)的蛋白水平。40μM奈非那韦处理24小时后，细胞内GSH水平也显著耗竭，表明奈非那韦诱导了GPX4-GSH系统的失调。

Nelfinavir促进GPX4的自噬降解

机制上，奈非那韦通过自噬促进GPX4蛋白降解。研究发现奈非那韦显著增加自噬空泡标志物LC3II的蛋白水平，自噬流实验证实奈非那韦在两种HCC细胞系中诱导了自噬。溶酶体抑制剂氯喹(CQ)而非蛋白酶体抑制剂硼替佐米(BZ)显著挽救了奈非那韦处理的细胞中GPX4的蛋白丰度。环己酰亚胺追踪实验进一步证明奈非那韦 dramatically 增加了GPX4的降解速率，而加入CQ抑制溶酶体后降低了这种降解。

内质网应激参与nelfinavir诱导的HCC细胞铁死亡

奈非那韦诱导内质网应激并激活PERK和IRE1α分支。内质网应激抑制剂TUDCA显著减轻奈非那韦诱导的内质网应激，表现为GRP78和CHOP蛋白表达减少，同时LC3II也显著降低。TUDCA dramatically 减弱了奈非那韦诱导的细胞死亡和脂质过氧化，并逆转了奈非那韦在Hepa1-6和HepG2细胞中降低的SLC7A11、GPX4和铁蛋白的蛋白表达，GSH水平也得到恢复。

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Nelfinavir通过内质网应激激活Nrf2/HO-1通路

奈非那韦显著上调Hepa1-6和HepG2细胞中Nrf2和HO-1的表达。TUDCA减弱内质网应激后，拮抗了奈非那韦相关的Nrf2和HO-1增加。奈非那韦增加了Hepa1-6和HepG2细胞中FerroOrange的荧光强度，而TUDCA显著降低了奈非那韦增加亚铁水平的能力。

Nelfinavir损害线粒体膜电位并促进超氧化物产生

奈非那韦处理显著降低了JC-1聚集体的红色荧光，但增加了JC-1单体的绿色荧光，表明奈非那韦损害了线粒体膜电位，导致线粒体功能障碍。同时，奈非那韦显著增加了Hepa1-6和HepG2细胞中MitoSox的红色荧光。内质网应激抑制剂TUDCA显著恢复了奈非那韦诱导的线粒体膜电位，并减弱了线粒体超氧化物的产生。

Nelfinavir增强sorafenib诱导的HCC细胞铁死亡

与单独使用索拉非尼相比，加入奈非那韦显著增加了索拉非尼在Hepa1-6和HepG2细胞中诱导的细胞死亡。联合指数(CI)值表明奈非那韦与索拉非尼在应用的剂量下对治疗HCC细胞具有协同作用。联合处理诱导的细胞死亡几乎完全被铁死亡抑制剂Fer-1挽救。同时，联合处理的MDA水平增加和GSH水平降低明显大于单独处理。蛋白质印迹分析显示奈非那韦和索拉非尼联合处理进一步降低了SLC7A11和GPX4的蛋白表达。

Nelfinavir和nelfinavir联合sorafenib抑制体内HCC肿瘤生长

在BALB/c裸鼠Hepa1-6皮下异种移植模型中，奈非那韦显著抑制肿瘤生长，而奈非那韦与索拉非尼联合治疗进一步延缓了肿瘤生长。奈非那韦或奈非那韦联合索拉非尼对小鼠体重没有明显影响。

本研究的重要结论在于揭示了奈非那韦通过内质网应激依赖性方式诱导铁死亡的新机制。奈非那韦激活内质网应激，导致GPX4/GSH系统下调、Nrf2/HO-1轴上调和线粒体损伤，最终引发HCC细胞铁死亡。研究人员建立了完整的作用模型：奈非那韦诱导内质网应激，进而通过自噬降解GPX4，下调SLC7A11和铁蛋白表达，同时激活Nrf2/HO-1轴增加亚铁离子水平，并引起线粒体功能障碍和超氧化物产生，这些变化共同促进了铁死亡的发生。

研究的讨论部分强调了这一发现的重大意义。内质网应激与铁死亡之间的相互关联为癌症治疗提供了新的视角。PERK信号激活通过上调p53下调SLC7A11转录，而ATF3以p53非依赖性方式抑制SLC7A11。PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路参与铁死亡诱导，其抑制可减弱铁死亡。IRE1α上调Xbp1激活Ga12，后者过表达下调GPX4。内质网应激还通过分子伴侣介导的自噬加速GPX4降解。

Nrf2作为应激诱导的转录因子，在抗氧化反应中扮演多面角色。激活的PERK磷酸化Nrf2并激活其转录活性以上调HO-1。HO-1通过增加铁积累和ROS产生促进铁死亡。本研究与先前研究一致，表明奈非那韦通过激活Nrf2-HO-1信号通路发挥铁死亡诱导剂作用。

线粒体在调控铁死亡中的参与进一步丰富了机制理解。线粒体相关ROS通过促进脂质过氧化参与铁死亡诱导。内质网应激期间，从内质网释放的Ca²⁺也促进线粒体ROS产生。内质网和线粒体之间的这种正反馈循环可能加剧奈非那韦诱导的铁死亡。

最重要的是，本研究证实奈非那韦与索拉非尼联合使用可协同下调SLC7A11和GPX4蛋白表达，在皮下异种移植HCC小鼠模型中抑制肿瘤生长。SLC7A11上调阻止脂质过氧化，这有助于索拉非尼获得性铁死亡耐药。奈非那韦加剧了索拉非尼引起的SLC7A11下调，使其成为与索拉非尼联合治疗HCC的理想药物。

这项研究不仅揭示了奈非那韦作为一种新型铁死亡诱导剂的作用机制，更重要的是为肝癌治疗提供了新的联合治疗策略。通过重新利用已获批药物的已知安全性和药代动力学特性，奈非那韦有望成为治疗HCC，特别是晚期和不可切除HCC的潜在治疗策略，为改善肝癌患者预后提供了新的希望。