猪场废水中日本脑炎病毒检测：RT-qPCR方法灵敏度与过程检测限的比较分析及其在疫情早期预警中的应用

本研究针对日本脑炎病毒（JEV）在猪场废水监测中的检测难题，系统比较了三种RT-qPCR方法（Universal JEV、JEV G4和VIDRL2 JEV G4）的检测性能。研究发现JEV G4方法展现出最优灵敏度（ALOD50为2.2拷贝/反应，PLOD50为72拷贝/10 mL），在实地样本中检出率达80%（24/30），显著优于其他方法。该研究为JEV基因4型流行区域的废水监测提供了高效检测方案，对疫情早期预警具有重要意义。

　　

日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）是一种由蚊子传播的黄病毒，在亚洲、西太平洋和澳大利亚地区引起严重的神经系统疾病，对人类健康和养猪业构成重大威胁。猪是JEV的关键扩增宿主，感染后会导致繁殖障碍如流产和死胎，而人类感染可能引发脑炎并留下长期后遗症。2022年JEV在澳大利亚东南部的突然出现，加剧了人们对其在适宜气候条件下再次暴发的担忧。

传统的JEV监测主要依赖临床样本的血清学检测和分子诊断，但这些方法存在采样侵入性强、耗时长以及交叉反应等问题，限制了其在大规模监测中的应用。近年来，废水监测作为一种新兴的公共卫生工具，在追踪病毒传播方面展现出巨大潜力。研究表明JEV可通过感染猪的尿液和粪便排出，因此监测猪场废水可能为疫情早期预警提供重要信号。然而，废水基质复杂、病毒浓度低以及存在PCR抑制剂等因素，对检测方法的灵敏度提出了更高要求。

针对这一挑战，研究人员在《Journal of Virological Methods》上发表了一项开创性研究，系统比较了三种RT-qPCR检测方法在猪场废水样本中检测JEV的性能。该研究由澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）环境研究所的团队完成，重点评估了Universal JEV、ACDP JEV G4和VIDRL2 JEV G4三种方法的检测灵敏度（ALOD）、过程检测限（PLOD）和病毒回收效率，并在真实猪场废水样本中验证了它们的实用性。

研究人员采用伽马辐照灭活的JEV毒株作为安全替代物，通过数字PCR（dPCR）精确量化病毒载量。研究使用吸附提取（AE）方法浓缩废水样本中的病毒颗粒，随后使用RNeasy PowerWater试剂盒提取核酸。通过概率回归分析确定各方法的ALOD和PLOD值，并计算不同浓度下的病毒回收率。最终，使用30份来自澳大利亚猪场的实地废水样本验证各方法的检测性能。

研究结果显示，三种RT-qPCR方法均表现出良好的线性关系（R2 ≥ 0.978）和符合MIQE指南的扩增效率（90-110%）。在ALOD比较中，Universal JEV和ACDP JEV G4方法表现出相当的灵敏度（ALOD₅₀分别为2.10和2.20拷贝/反应），而VIDRL2 JEV G4方法的灵敏度显著较低（ALOD₅₀为5.60拷贝/反应）。

更为重要的是过程检测限（PLOD）的评估结果，这直接反映了方法在真实废水样本中的检测能力。ACDP JEV G4方法展现出最优的PLOD值（PLOD₅₀为72.0拷贝/10 mL），明显优于Universal JEV方法（PLOD₅₀为80.8拷贝/10 mL）和VIDRL2 JEV G4方法（PLOD₅₀为1000拷贝/10 mL）。这表明ACDP JEV G4方法更适合检测低病毒载量的废水样本。

在病毒回收率方面，ACDP JEV G4方法表现出最稳定的一致性，在不同浓度样本中的回收率保持在14.9-26.6%之间。相比之下，Universal JEV方法的回收率在不同样本间变异较大（9.35-45.9%），而VIDRL2 JEV G4方法虽然在某些高浓度样本中回收率较高（70.2%），但在低浓度样本中无法可靠检测。

实地样本检测结果进一步证实了ACDP JEV G4方法的优越性。在30份猪场废水样本中，ACDP JEV G4方法检测出24份阳性样本（80%），显著高于Universal JEV方法的17份阳性（57%）和VIDRL2 JEV G4方法的零检测。McNemar统计检验证实ACDP JEV G4方法的灵敏度显著更高（p < 0.05）。

讨论部分指出，虽然Universal JEV方法设计用于检测所有JEV基因型，但其通用性可能以牺牲对特定基因型的灵敏度为代价。ACDP JEV G4方法专门针对基因4型（与澳大利亚疫情相关）设计，这解释了其在当地样本中的优异表现。VIDRL2 JEV G4方法灵敏度较低可能与其使用简并引物有关，这些引物可能降低结合效率并增加非特异性扩增风险。

该研究的局限性包括使用伽马辐照病毒可能无法完全模拟感染性病毒颗粒的行为，仅测试两种废水样本限制了结果的普适性，以及未比较其他病毒浓缩方法如超滤或聚乙二醇沉淀。未来研究应探索更接近活病毒行为的替代物，扩大样本量以涵盖更多样的废水基质，并比较多种浓缩方法以进一步优化检测灵敏度。

结论表明，基于实证数据，ACDP JEV G4方法因其高灵敏度和稳定性能，被推荐用于基因4型流行区域的废水监测。在存在多种基因型的地区，可采用ACDP JEV G4与Universal JEV双重检测策略，以平衡灵敏度和广谱检测能力。实施猪场废水监测项目应结合临床和血清学数据，为JEV传播提供全面监测网络，为早期预警和疫情控制提供关键技术支持。

这项研究不仅为JEV监测提供了方法学指导，也为其他病毒性病原体的废水监测建立了可借鉴的技术框架，对未来新发传染病的早期预警系统建设具有重要意义。