红细胞凝集反应中宏观与微观光吸收特性的比较分析及其在H1N1病毒检测中的应用

本综述通过系统性比较红细胞（RBC）凝集（HA）反应中宏观与微观水平的光吸收行为，揭示了RBC浓度对光学密度（OD）的临界效应。研究发现凝集反应会在480–520 nm波长区间产生特征性OD饱和或下降现象，并提出基于UV-Vis光谱的HA检测新策略（包括病毒检测与血型鉴定），为开发新型POCT诊断平台提供了物理机制依据。

　　

Highlight

我们通过宏观与微观分析揭示了红细胞凝集反应中的光学吸收特性。红细胞具有独特的光吸收峰（包括Soret带、Q_v和Q_o），其在明场显微镜下呈现暗色对比，表明局部光密度（OD）增加。通过系统分析宏观/微观OD测量和UV-Vis光谱，我们建立了红细胞凝集与非凝集的唯象模型：抗原-抗体反应是临界浓度下的突变事件，红细胞网络形成会导致OD在凝集时下降或饱和，而非凝集时随浓度持续上升。UV-Vis分析表明480–520 nm是避开红细胞特征峰的HA检测最优波长。我们进一步通过H1N1甲型流感病毒检测验证了OD基HA assay的实用性。

Macroscopic and microscopic analysis of hemagglutination

我们利用传统UV-Vis光谱研究了红细胞凝集行为的基础物理特性。在诸多影响因素（如红细胞浓度、抗体浓度、反应时间和震荡）中，我们聚焦于红细胞浓度在平底微孔板中对凝集与非凝集行为的作用。平底微孔板的使用使我们能够从物理和形态学角度解释光吸收现象。

Coordination of 96 microwell plate with RBC concentration variation

我们通过将红细胞悬液与抗体试剂在96孔板中混合设计HA反应。为系统分析凝集与非凝集，我们通过滴定A型细胞和B型细胞的红细胞悬液（抗A和抗B抗体体积恒定）来协调微孔板布局（图3）。为获得不同浓度红细胞，我们将1 mL Affirmagen红细胞悬液以300 rpm离心，沉淀用100 μL PBS重悬，最终得到浓缩红细胞悬液。

High RBC concentration is needed for sufficient OD contrast between agglutination and non-agglutination

我们报告了宏观OD与红细胞网络化微观事件之间的关系。在红细胞凝集过程中，网络化的启动会开辟光线可穿透的空隙区域，最终降低宏观OD。本研究的一个局限是结论仅适用于高浓度红细胞（32%–64%），以获得低-高-高-低OD模式（如图6讨论），这与图4的可行性测试一致。随着红细胞浓度降低，OD对比度显著减弱。

Conclusion

我们提供了红细胞凝集 assay 中宏观与微观光吸收特性的系统性分析。当红细胞凝集发生时，光线通过红细胞网络或团块间的透明区域形成光路，导致OD下降或饱和。红细胞团块网络化在特定临界浓度以上被视为突变事件，与红细胞网络化的启动相关。OD的降低源于红细胞团块间透明区域的开放。