祖源耗竭PD-1+ T细胞是动脉粥样硬化中免疫检查点抑制的关键细胞靶点

本研究发现，表达中等水平PD-1（PD-1int）的祖源耗竭T细胞是动脉粥样硬化小鼠主动脉中促炎细胞因子的主要来源，并且是免疫检查点抑制剂（ICI）驱动动脉粥样硬化免疫反应的潜在细胞靶标。研究进一步证明，在亚临床心血管疾病患者中，循环中表达PD-1的T细胞水平升高，为理解ICI相关心血管风险提供了关键机制见解。

　　

引言：免疫检查点抑制剂与心血管风险的新关联

免疫检查点抑制剂（ICI），特别是靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的药物，在癌症治疗中取得了显著成功，但同时也伴随着心血管事件风险增加的问题。然而，其背后的机制尚不明确。动脉粥样硬化作为一种慢性炎症性疾病，T细胞通过释放细胞因子（如IFNγ）和细胞间相互作用在调控斑块炎症中扮演核心角色。先前研究表明，失去T细胞抑制性检查点受体信号会促进斑块炎症和T细胞积累。尽管ICI疗法与心血管风险增加相关，但检查点受体抑制如何转化为心血管风险的机制性认识仍然缺乏。

主动脉IFNγ⁺ T细胞的特征：PD-1高表达

为了表征动脉粥样硬化主动脉中产生IFNγ的T细胞，研究团队构建了高胆固醇饮食（HCD）喂养的^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠模型。该细胞因子报告株系允许直接检测当前正在产生IFNγ的细胞，而无需体外再刺激。结果显示，与IFNγ^? T细胞相比，主动脉IFNγ⁺ CD4和CD8 T细胞上的PD-1表达水平显著升高。在不同组织中评估PD-1⁺ T细胞水平发现，主动脉中的PD-1⁺ CD4和CD8 T细胞相对于淋巴结和血液均有增加。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析进一步揭示，PD-1⁺记忆T细胞中表达了多种与T细胞耗竭和效应功能相关的转录本，包括^Tox、^Rgs16、^Lag3和^Havcr2。

PD-1⁺主动脉T细胞呈现祖源耗竭表型

反复的抗原接触会使T细胞逐渐向耗竭状态发展，其特征是对抗原再刺激的反应减弱、产生细胞因子的能力有限以及免疫检查点受体（如PD-1和LAG3）的上调。为了更好理解动脉粥样硬化主动脉中PD-1⁺ T细胞的表型，研究将其与肿瘤浸润T细胞进行了比较。实验将MC38结肠腺癌细胞植入HCD喂养的^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠侧腹，并在接种后2周收集主动脉和肿瘤。

通过表面蛋白Slamf6和Tim3的表达对T细胞进行分析，可以将其分为不同的耗竭状态亚群：Slamf6⁺Tim3^?（祖源耗竭）、Slamf6⁺Tim3⁺（早期耗竭）和Slamf6^?Tim3⁺（晚期耗竭）。研究发现，与肿瘤相比，主动脉中的PD-1^int和PD-1^high CD4和CD8 T细胞几乎完全是Slamf6⁺Tim3^?祖源耗竭表型。此外，与主动脉相比，肿瘤中PD-1^high CD4和CD8 T细胞上的Lag3表达水平更高，这与肿瘤中耗竭状态升高一致。在动脉粥样硬化主动脉中，IFNγ–YFP⁺ CD4和CD8 T细胞主要是Slamf6⁺Tim3^?祖源耗竭T细胞，而肿瘤中的细胞因子产生T细胞则具有混合表型。

主动脉PD-1表达T细胞具有多功能性

耗竭的T细胞功能能力下降，而祖源耗竭的T细胞通常表现出高度的多功能性。指示近期增殖的标志Ki67在PD-1^int和PD-1^high亚群中的表达并未减少。同样，在脾脏中，PD-1表达T细胞的Ki67水平也未观察到下降。接下来，研究测试了PD-1⁺主动脉T细胞共同产生白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）以及IFNγ的能力，因为细胞因子“多功能性”的丧失与终末耗竭相关。离体刺激实验显示，PD-1^int或PD-1^high主动脉IFNγ⁺ CD4或CD8 T细胞共同产生TNF和IL-2的能力并未降低。耗竭相关转录因子Tox在PD-1^high主动脉T细胞中的水平升高。此外，主动脉产生IFNγ的PD-1表达CD4和CD8 T细胞均表现出记忆表型。总之，主动脉PD-1⁺ T细胞在功能上并未耗竭，保留了在再刺激时增殖和产生多种细胞因子的能力。

主动脉PD-1⁺ T细胞表达CD69并显示近期TCR信号迹象

PD-1在近期TCR信号应答中短暂上调，并在祖源或晚期耗竭T细胞上保持升高。为了探索耗竭相关标志物的表达是否与近期TCR信号相关，研究分析了从^{Nur77wt/GFPApoe?/?}报告小鼠分离的T细胞。在这些小鼠中，T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的产生量与近期TCR信号量成正比，反映了T细胞的启动、再激活或强直信号。支持主动脉PD-1⁺ T细胞中近期TCR激活的发现是，主动脉Nur77–GFP⁺ CD4和CD8 T细胞上PD-1、Slamf6和Tim3的表面水平表达高于Nur77–GFP^?的对应细胞。

PD-1也在其他T细胞亚群上表达，包括CXCR5⁺ T滤泡辅助细胞（T_FH）和CD69⁺CD103^+/?组织驻留记忆（T_RM）细胞。分析HCD喂养的^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠主动脉，观察到主动脉PD-1⁺CD4⁺ T细胞上CXCR5表达很少，表明这些细胞与淋巴组织T_FH细胞不同。为了表征主动脉PD-1⁺ T细胞的T_RM样表型，进行了CD69和CD103的流式细胞术分析。观察到PD-1^int和PD-1^high T细胞中CD69⁺以及有限程度上的双阳性CD69⁺CD103⁺水平逐步增加，表明早期耗竭和T_RM样表型之间存在重叠。

CD69在近期激活的T细胞和T_RM细胞上均有表达。为了区分这些群体，研究分析了来自HCD喂养的^{IfngYFP/YFPNur7wt/GFPApoe?/?}小鼠主动脉T细胞上的CD69和Nur77–GFP。发现了四个不同的群体。研究发现，与PD-1^?和PD-1^int亚群相比，PD-1^high CD4 T细胞显示出近期TCR激活的迹象（Nur77–GFP⁺CD69⁺）。对于CD8 T细胞，在PD-1^int/high T细胞中观察到Nur77–GFP和CD69的上调，然而阳性水平明显低于斑块CD4 T细胞。

为了探索动脉粥样硬化小鼠主动脉T细胞的耗竭表型是否是过度IL-2信号传导的结果，研究给^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠注射了阻断性单克隆抗IL-2抗体或同型对照IgG。然而，短期IL-2阻断并不影响CD4或CD8 T细胞的PD-1亚群组成、SLAMF6/Tim3表达模式或斑块中的IFNγ产生。总的来说，这些结果表明主动脉T细胞上的PD-1表达，尤其是CD4 T细胞，与近期TCR信号相关，并且主动脉驻留的PD-1⁺ CD8 T细胞以CD69表达为特征。

斑块抗原扩增的T细胞表达TOX

针对斑块抗原的自身免疫已在动脉粥样硬化小鼠模型中被观察到。为了研究斑块抗原特异性T细胞的耗竭表型，研究使用了CD45.1同系载脂蛋白B反应性TCR转基因小鼠（apoB反应性T细胞品系3；BT3），其中TRBV31⁺ CD4 T细胞针对人载脂蛋白B-100（apoB-100）的肽序列发生反应。将来自CD45.1⁺ BT3小鼠的CD4 T细胞过继转移到产生人apoB-100的动脉粥样硬化小鼠（^{APOB100TgLdlr?/?}；HuBL小鼠）中。HuBL受体小鼠在转移后喂养HCD 3周，直至安乐死和分析apoB反应性CD4 T细胞。

反映高胆固醇血症小鼠中apoB-100特异性T细胞的慢性激活，转基因CD4 T细胞（来自BT3供体的CD45.1⁺TRBV31⁺）与脾脏和非转基因记忆CD4 T细胞（CD44⁺CD45.1^?）相比，表现出高PD-1表达。脾脏中apoB特异性BT3 T细胞显示Tim3⁺表达水平增加，并且转录因子Tox的水平显著升高，在淋巴结中也观察到类似趋势。

接下来，研究测试了人类斑块中扩增的T细胞克隆（可能包含推定的斑块抗原特异性T细胞以及对病原体反应的T细胞）是否表现出让人联想到apoB-100自身反应性转基因BT3 T细胞的表型。为此，分析了人类颈动脉斑块的scRNA-seq数据，并比较了非扩增（单克隆）与扩增（≥2个克隆）的CD4和CD8 T细胞中的基因表达。尽管未观察到强劲的^PDCD1表达，但扩增的CD4和CD8 T细胞均显示几种与效应功能和耗竭相关基因的表达增加，包括基因^TOX、^EOMES和^TBX21以及CD8 T细胞中的^LAG3。

PD-1阻断使主动脉T细胞向PD-1^high表型转变并增加IFNγ产生

近期研究表明，接受抗PD-1 ICI治疗的患者发生动脉粥样硬化性心血管事件的风险增加，但关于这种治疗如何影响主动脉T细胞表型的认识缺乏。为了解决这个问题，研究给HCD喂养10周的^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠注射了双周次的抗PD-1抗体或同型IgG对照，总共6周。为此，使用了鼠源化的RMP1.14抗PD-1抗体，以最大限度地减少针对注射的抗PD-1抗体的抗体出现。

与之前的报告一致，观察到抗PD-1治疗的小鼠与对照小鼠相比，主动脉瓣横截面的斑块大小没有差异。抗CD3的免疫组化染色显示，抗PD-1治疗的小鼠斑块中T细胞大量流入。相应地，流式细胞术分析表明PD-1阻断后主动脉T细胞数量增加。

接下来，评估了PD-1阻断如何影响动脉粥样硬化主动脉中的T细胞组成。观察到抗PD-1治疗的小鼠记忆T细胞显著向PD-1^high表型转变。这种效应在CD8 T细胞中最为明显，抗PD-1治疗的小鼠中约有75%的PD-1^high T细胞，而同型对照治疗的小鼠中约为20%。祖源耗竭PD-1^int T细胞在ICI驱动的分化中能够分化为PD-1^high T细胞，其在主动脉中的数量保持不变。

抗PD-1治疗与小鼠肿瘤中晚期耗竭PD-1⁺Tim3⁺ T细胞频率增加相关。类似地，在抗PD-1治疗后，动脉粥样硬化主动脉中观察到PD-1⁺Tim3⁺ CD8 T细胞水平显著增加，PD-1⁺Tim3⁺ CD4 T细胞水平也有增加趋势，表明从祖源耗竭CD8 T细胞生成了更多的PD-1⁺Tim3⁺晚期耗竭T细胞。这些变化伴随着PD-1阻断后YFP⁺ IFNγ产生T细胞的增加。通过免疫组化分析，观察到与对照IgG治疗小鼠（未观察到）相比，抗PD-1治疗小鼠主动脉窦斑块和外膜中CD3⁺ T细胞灶的形成。在一个晚期外膜T细胞灶中，观察到相邻CD19⁺ B细胞的积累，提示早期三级淋巴结构形成。在一个单独的队列中，验证了并发的MC38肿瘤负荷不会显著改变抗PD-1驱动的T细胞向斑块的募集。

为了评估抗PD-1治疗如何影响斑块中髓系细胞的积累，进行了Ly6G（中性粒细胞）和CD68（巨噬细胞）的免疫组化评估。在抗PD-1治疗小鼠的斑块和外膜中观察到Ly6G⁺中性粒细胞水平升高，但CD68⁺斑块巨噬细胞水平没有显著变化。为了获得关于PD-1阻断如何影响斑块表型的更多见解，进行了对照IgG治疗和抗PD-1治疗小鼠的空间转录组学分析。差异基因表达分析揭示了抗PD-1治疗斑块中几个显著上调的基因：^Saa3、^Lcn2、^Mmp3和^Ccl8。此外，还观察到与T细胞和中性粒细胞趋化性相关基因（^Cxcl5和^Cxcl9）的转录增加，尽管在进行多重检验校正后未达到显著性阈值。分析血浆发现，抗PD-1治疗小鼠中IFNγ诱导的细胞因子CXCL9和CXCL10水平升高，以及CCR5配体CCL4水平升高。抗PD-1治疗不影响血浆IL-6和TNF水平，并且观察到IL-4和CCL2水平均降低。总之，抗PD-1治疗促进了PD-1^high晚期耗竭T细胞在斑块中的显著积累，并增加了IFNγ产生水平，通过趋化因子产生和中性粒细胞流入增加创造了一个促炎环境。

预先清除PD-1^high T细胞不损害抗PD-1驱动的斑块T细胞积累

先前在癌症和自身免疫中的研究强调，PD-1^int祖源耗竭T细胞，而非晚期耗竭PD-1^high T细胞，是免疫检查点抑制的细胞靶标。抑制PD-1^int T细胞上的PD-1信号已被证明可促进其增殖并分化为肿瘤中的PD-1^high T细胞。然而，尚不清楚哪个PD-1亚群（PD-1^int或PD-1^high）负责促进抗PD-1驱动的动脉粥样硬化斑块中T细胞积累。为了解决这个问题，研究给HCD喂养的^{IfngYFP/YFPApoe?/?}小鼠注射了三剂非阻断性PD-1^high清除抗体（克隆RMP1.30），以在施用抗PD-1阻断抗体（克隆RMP1.14）2周之前清除PD-1^high T细胞，直至安乐死。该设计使得能够测试PD-1^high T细胞对于抗PD-1驱动的斑块T细胞积累是否是必需的。为了控制PD-1^high清除本身的影响，还包含了持续接受RMP1.30治疗所有3周的小鼠。

在接受RMP1.30后再接受抗PD-1治疗的小鼠中，在治疗第7天检测到有效的PD-1^high清除，并且在转换为抗PD-1治疗后循环CD8 PD-1^high T细胞随后增加，而循环PD-1^int T细胞水平未受影响。接下来，测试了用RMP1.30预先清除PD-1^high T细胞是否会减轻对PD-1阻断反应的斑块T细胞积累。值得注意的是，尽管两组接受最后2周抗PD-1治疗的小鼠均显示斑块T细胞水平升高，但RMP1.30预处理并未破坏PD-1阻断驱动的T细胞积累。

通过流式细胞术分析主动脉消化物显示，RMP1.30治疗对减少定义为PD-1^intSlamf6⁺Tim3^? T细胞或CD44⁺PD-1^int的祖源耗竭T细胞数量没有影响。与血液中类似，观察到持续接受RMP1.30治疗的小鼠主动脉PD-1^high CD4和CD8 T细胞数量减少。值得注意的是，与未经预清除的PD-1阻断相比，接受短暂RMP1.30治疗的小鼠并未表现出显著更低的PD-1^high T细胞数量，这可能是由于对PD-1阻断反应中PD-1^high T细胞的扩张。抗PD-1治疗增加了主动脉T细胞的IFNγ产生水平，但RMP1.30治疗预先清除PD-1^high T细胞并未改善细胞因子产生。总之，这些结果表明PD-1^high T细胞不是抗PD-1驱动的斑块T细胞积累所必需的，并且与PD-1^int T细胞在协调ICI驱动的动脉粥样硬化中T细胞积累的关键作用一致。

人类PD-1⁺ T细胞产生IFNγ并与冠状动脉粥样硬化存在相关

在动脉粥样硬化小鼠中的结果表明，PD-1⁺表达T细胞可能促进斑块炎症。为了测试循环PD-1⁺ T细胞水平是否与人类动脉粥样硬化相关，分析了来自瑞典心肺生物图像研究（SCAPIS）中招募的65-72岁个体的血液样本。这些个体中的大多数在4-8年前接受过心脏计算机断层扫描血管造影（CCTA），并在随访时采集血液进行外周血单核细胞（PBMC）分离，并评估临床化学读数（高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯和葡萄糖）。

在循环CD4 T细胞中，PD-1表达主要局限于T中央记忆（T_CM）和T效应记忆（T_EM）亚群，而循环PD-1⁺ CD8 T细胞主要包含T_EM和重新表达CD45RA的T效应记忆细胞（T_EMRA）亚群。首先评估了PD-1亚群与代谢读数之间的关联。除了总胆固醇与PD-1⁺ CD8 T细胞之间呈负相关，以及PD-1⁺ CD4 T细胞与HDL胆固醇呈负相关外，其他代谢参数（LDL、甘油三酯、葡萄糖或血红蛋白A1c）与PD-1⁺亚群无关。

作为冠状动脉粥样硬化的衡量标准，使用了节段受累评分（SIS），即量化含有动脉粥样硬化斑块的冠状动脉节段数量，无论斑块严重程度或狭窄程度如何。将个体按无（SIS < 1）或有（SIS ≥ 1）冠状动脉粥样硬化分层。有斑块个体中PD-1⁺ CD4和PD-1⁺ CD8的水平均显著高于无斑块个体。在调整了年龄和性别后，PD-1⁺ CD8 T细胞与斑块存在之间的关联仍然具有统计学意义，并且在进一步调整了葡萄糖、LDL、HDL、总胆固醇和甘油三酯后，以及额外调整了糖尿病和当前吸烟后仍然显著。PD-1⁺CD4 T细胞与斑块存在之间的关联在调整后不再具有统计学意义。此外，还分析了PD-1⁺ T细胞水平与杜克预后冠状动脉疾病评分（Duke评分）之间的关联，杜克评分是一个评估斑块位置和狭窄程度的综合评分。结果表明PD-1⁺亚群与Duke评分存在关联，特别是PD-1⁺ CD8 T细胞，其在调整年龄和性别后与Duke评分的关联仍然显著，但在调整其他风险因素后不再显著。PD-1⁺ CD8 T细胞和PD-1⁺ CD4 T细胞均与冠状动脉钙化评分无显著关联。

最后，测试了人类PD-1⁺ T细胞是否具有增加的产生IFNγ的能力，正如在动脉粥样硬化小鼠中观察到的那样。为此，将来自一部分SCAPIS参与者的PBMCs与（1）单独培养基、（2）激动性抗CD3和共刺激或（3）T细胞激活细胞因子（IL-12/IL-15/IL-18）一起培养24小时，并在最后5小时存在布雷菲德菌素A的情况下量化IFNγ的产生。在未刺激的T细胞中未观察到IFNγ产生的差异。激动性抗CD3和共刺激处理促进了PD-1⁺ T细胞中IFNγ产生的增加，但正如预期的那样，也导致了激活的CD4和CD8 T细胞上PD-1的重新表面表达。然而，不增加PD-1表达的先天细胞因子刺激（旁观者激活）同样证明，与PD-1^? T细胞相比，PD-1表达T细胞中IFNγ产生率升高。这些研究表明，PD-1⁺ T细胞可以通过经典的TCR介导和细胞因子介导的激活被激活，导致与PD-1^? T细胞相比更高水平的IFNγ阳性。

讨论：PD-1在动脉粥样硬化中的抑制性作用与临床意义

ICI疗法在限制癌症患者肿瘤生长方面取得了显著成功，但同时也与心血管疾病风险增加相关。本研究证明PD-1由主动脉IFNγ产生、祖源耗竭T细胞表达，并且免疫检查点阻断促进了动脉粥样硬化主动脉中T细胞的IFNγ产生。提供了PD-1表达与人类动脉粥样硬化之间联系的是，研究表明PD-1⁺ T细胞水平与亚临床冠状动脉粥样硬化的存在相关。研究结果证明PD-1在抑制动脉粥样硬化中促炎T细胞的活性方面发挥作用，为理解与ICI疗法相关的增加的心血管风险提供了机制性见解。

随着越来越多的癌症患者从ICI中长期生存获益，减轻心血管风险成为一个日益相关的临床优先事项。需要识别ICI驱动心血管风险的生物标志物，以 pinpoint 癌症预后良好、将从心脏监护或免疫调节治疗中受益的个体。限制IFNγ信号传导的影响可能是对抗ICI驱动心血管疾病的潜在策略。然而，针对IFNγ信号本身需要谨慎，因为用Janus激