无标记光声成像技术用于研究玻璃蛙的发育过程

《Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements》：Label-free Photoacoustic Imaging of Glassfrog Development

光声显微镜（PAM）在玻璃青蛙胚胎发育和成年个体血管动力学研究中的应用。通过超光谱PAM（HS-PAM）结合多波长成像（266nm、430nm、532nm、670nm、1210nm），实现了胚胎神经板形成、血 vessels发育及脂质分布的细胞级分辨率观察。超快功能PAM（UFF-PAM）可实时追踪血红蛋白氧饱和度（sO?），成功解析麻醉与清醒状态下血管动态变化。首次利用HS-PAM对骨骼肌、肝及脂肪组织进行无标记组织成像，发现肌纤维中肌红蛋白吸收430nm光，脂肪组织1210nm波长显影脂滴。研究证实PAM技术适用于脊椎动物多尺度、多分子探针的无创成像，为发育生物学和生物医学研究提供新工具。

　　本研究围绕着利用先进的光声显微镜技术（Photoacoustic Microscopy, PAM）对两栖动物的发育过程和组织结构进行深入探索。两栖动物，尤其是玻璃蛙（glassfrog），因其快速的生长速度、透明的组织结构以及在发育生物学研究中的广泛应用，成为一种理想的实验模型。光声显微镜技术作为一种无标记成像方法，能够通过分子对光的吸收特性，实现对生物组织的结构和功能信息的同步采集。这为理解胚胎发育、器官形成以及血液动力学变化提供了新的视角。

### 一、研究背景与意义

两栖动物在生物学研究中占据着重要地位，它们的胚胎发育过程和组织结构为揭示脊椎动物的发育机制提供了丰富的资料。两栖动物具有与脊椎动物相似的生理和解剖特征，但又展现出独特的生物学特性，如高度透明的组织、丰富的色素沉积以及复杂的生理适应机制。这些特性使得它们成为研究胚胎发育、组织分化以及生理功能变化的天然实验材料。玻璃蛙，作为研究对象之一，其透明的组织结构使得研究其内部生理过程成为可能。这种特性不仅有助于观察胚胎的发育，还为研究其血液流动、组织代谢以及生理调节机制提供了独特的窗口。

传统的显微镜技术，如光学显微镜和组织切片染色技术，虽然在研究胚胎发育方面取得了显著进展，但其局限性在于对深层组织的成像能力不足。此外，许多光学方法在成像过程中需要使用染料或标记物，这可能会对生物组织产生干扰或毒性。相比之下，光声显微镜技术不需要标记物，能够提供高分辨率的成像，同时避免了传统方法的局限性。通过该技术，研究人员可以观察到生物组织中各种内源性分子的分布情况，包括DNA、RNA、卵黄蛋白、脂质、血红蛋白和黑色素等。

### 二、研究方法与技术

在本研究中，采用了两种互补的光声显微镜技术：**高光谱光声显微镜（HS-PAM）** 和 **超快速功能光声显微镜（UFF-PAM）**。HS-PAM通过多种波长的光激发，能够实现对生物组织的高分辨率成像，适用于**体外**环境下的细胞级观察。UFF-PAM则能够实时捕捉血液流动的变化，并量化血红蛋白的氧饱和度（sO?），适用于**体内**环境下的动态观察。

HS-PAM的原理基于不同波长的光对生物分子的吸收特性。例如，紫外线（UV）波段（约266 nm）可以用于检测细胞核内的DNA或RNA，而可见光波段（如430 nm、532 nm、670 nm）则可以用于识别卵黄蛋白、血红蛋白以及脂肪组织中的脂质。此外，近红外波段（如1210 nm）能够检测脂肪组织中脂质的分布情况，通过脂质分子的第二泛频振动来增强成像对比度。而UFF-PAM则通过快速的激光脉冲和同步的超声波检测，能够实时监测血液流动和氧合状态，特别是在动物清醒和活动状态下的变化。

### 三、实验对象与成像过程

本研究选取了多种两栖动物作为实验对象，包括**玻璃蛙**（Teratohyla pulverata）、**Fleischmann’s玻璃蛙**（Hyalinobatrachium fleischmanni）、** hatchet-faced树蛙**（Sphaenorhynchus lacteus）以及**Hourglass树蛙**（Dendropsophus ebraccatus）。这些物种在生理和解剖结构上具有多样性，为研究不同发育阶段和组织类型的成像提供了广泛的基础。

对于玻璃蛙胚胎的观察，研究团队利用HS-PAM在**体外**环境下对其从神经管形成阶段到蝌蚪阶段的形态变化进行了连续监测。通过不同波长的光激发，研究人员能够识别胚胎内部的细胞结构、血管网络以及不同组织的分布情况。例如，在430 nm波长下，可以观察到卵黄蛋白的分布；而在670 nm波长下，则能够识别胚胎中的蓝色蛋白，如与卵黄结合的胆绿素结合蛋白。这些分子的吸收特性为区分不同组织结构提供了重要的依据。

在成年玻璃蛙的体内成像方面，研究团队使用UFF-PAM对两种玻璃蛙的血液动力学变化进行了研究。在麻醉状态下，研究人员能够观察到玻璃蛙体内血管网络的分布情况，并记录其血液氧合状态的变化。而在清醒状态下，通过UFF-PAM的高帧率成像能力，研究人员能够捕捉到玻璃蛙在自由活动状态下的血液循环变化，包括心率、呼吸节律以及血管网络的动态变化。这些成像结果不仅揭示了玻璃蛙的生理特征，还为研究其适应性机制提供了新的线索。

此外，研究团队还对其他树蛙的组织结构进行了成像，包括**骨骼肌、肝脏和脂肪组织**。通过HS-PAM的多波长成像能力，研究人员能够区分这些组织中的不同分子成分。例如，在骨骼肌中，通过430 nm波长可以观察到肌红蛋白的吸收特性，而通过1210 nm波长则可以检测脂肪组织中的脂质分布。这些结果表明，HS-PAM能够有效地揭示不同组织的微观结构和功能特征。

### 四、研究发现与意义

本研究的一个重要发现是，玻璃蛙的透明组织特性使其成为研究体内发育过程的理想模型。通过HS-PAM和UFF-PAM的结合使用，研究人员不仅能够观察到胚胎发育的各个阶段，还能实时监测成年玻璃蛙的血液流动和氧合状态。这些发现为理解两栖动物的发育生物学提供了新的工具和方法。

在玻璃蛙的胚胎发育过程中，研究人员观察到多种分子的分布变化。例如，在神经管形成阶段，胚胎的形态变化可以通过HS-PAM的高分辨率成像技术进行记录。随着胚胎的发育，血管网络逐渐形成，而卵黄蛋白和脂质的分布也发生了显著变化。这些变化不仅反映了胚胎发育的进程，还揭示了不同分子在组织形成中的作用。

在成年玻璃蛙的体内成像中，研究人员发现其肝脏和肌肉组织中的血管网络具有独特的结构。例如，肝脏中的血管分布与肌肉组织中的血管网络不同，这可能与其代谢功能有关。此外，玻璃蛙的皮肤和趾部也展现出独特的分子分布模式。通过HS-PAM的多波长成像，研究人员能够识别皮肤中的色素分布，如黄色或橙色的类胡萝卜素，以及趾部的腺体结构。

在血液动力学方面，UFF-PAM的使用使得研究人员能够实时监测玻璃蛙的血液循环。例如，在麻醉状态下，玻璃蛙的血红蛋白氧合状态发生变化，这可能与其代谢活动降低有关。而在清醒状态下，玻璃蛙的血液流动更加活跃，表明其生理活动水平的提高。这些发现为理解两栖动物的生理调节机制提供了重要的依据。

### 五、技术优势与应用前景

本研究的另一个重要贡献是展示了HS-PAM和UFF-PAM在两栖动物研究中的广泛适用性。HS-PAM能够提供高分辨率的组织成像，适用于多种生物分子的检测。而UFF-PAM则能够实时捕捉血液流动和氧合状态的变化，适用于动态生理过程的观察。这两种技术的结合，使得研究人员能够在**体外**和**体内**环境下，对两栖动物的发育过程和生理功能进行系统研究。

HS-PAM的高光谱成像能力使得研究人员能够区分不同组织中的分子成分。例如，通过不同的波长，可以识别细胞核、卵黄蛋白、血红蛋白、脂质以及黑色素等分子的分布情况。这种无标记成像技术不仅减少了对生物样本的干扰，还提高了成像的准确性和可靠性。

UFF-PAM的快速扫描能力则为研究动态生理过程提供了重要支持。例如，在玻璃蛙恢复意识的过程中，研究人员能够实时监测其血液氧合状态的变化，以及血管网络的动态调整。这种技术的应用，使得研究者能够捕捉到生物体在不同生理状态下的变化，从而更全面地理解其生理机制。

### 六、研究的创新点与未来方向

本研究的一个创新点在于结合HS-PAM和UFF-PAM技术，对两栖动物的发育过程和生理功能进行了系统性的研究。这种多模态成像方法不仅提高了研究的精度，还拓展了光声显微镜的应用范围。此外，研究团队还对多种树蛙的组织结构进行了成像，进一步验证了HS-PAM的适用性。

研究的另一个创新点在于对玻璃蛙的血液动力学变化的实时监测。通过UFF-PAM的高帧率成像，研究人员能够捕捉到玻璃蛙在清醒和麻醉状态下的血液循环变化，为理解其生理调节机制提供了新的视角。这些发现不仅有助于揭示玻璃蛙的生理特性，还为其他两栖动物的研究提供了参考。

未来，光声显微镜技术在两栖动物研究中的应用可以进一步拓展。例如，可以用于研究其他两栖动物的发育过程，以及探索不同环境条件下的生理变化。此外，该技术还可以用于研究两栖动物的代谢功能、免疫反应以及疾病机制。通过不断优化成像技术和数据处理方法，光声显微镜有望成为一种更加广泛使用的生物成像工具。

### 七、结论与展望

综上所述，本研究通过HS-PAM和UFF-PAM技术，对两栖动物的发育过程和生理功能进行了深入探索。这些技术不仅能够提供高分辨率的组织成像，还能实时监测血液流动和氧合状态的变化。研究结果表明，光声显微镜技术在两栖动物研究中具有重要的应用价值，特别是在发育生物学和生理学领域。

随着技术的不断进步，光声显微镜的应用范围将进一步扩大。未来的研究可以探索更多两栖动物的生理和发育特性，同时结合其他成像技术，如光学相干断层扫描（OCT）或荧光显微镜，以提高研究的全面性和准确性。此外，该技术还可以用于研究两栖动物在不同环境条件下的适应性变化，为理解生物进化和生态适应性提供新的视角。

总之，本研究不仅展示了光声显微镜技术在两栖动物研究中的潜力，还为未来的研究提供了新的方法和思路。通过这些技术，研究人员能够更深入地探索生物体的发育过程和生理功能，为生物学、医学以及生物工程领域的发展做出重要贡献。