PI3K–mTOR双重靶向抑制p85β:H3K27Me3转换：重塑三阴性乳腺癌免疫微环境与转移机制

本文深入探讨了PI3K–mTOR双重抑制剂paxalisib在三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中的突破性作用。研究揭示其通过抑制p85β核转位，阻断EZH2介导的H3K27Me3表观沉默与NF-κB炎症通路，逆转上皮-间质转化（EMT），降低肿瘤干细胞（CSC）特性，并重塑肿瘤免疫微环境（TIME），增强免疫治疗响应。该研究为TNBC耐药患者提供了新的联合治疗策略。

　　

摘要

三阴性乳腺癌（TNBC）患者中近半数发生远处转移，预后极差。本研究揭示PI3K–mTOR通路在TNBC生长、迁移、转移及治疗抵抗中的关键作用。双重抑制PI3K和mTOR（而非单独抑制PI3K）可显著抑制癌细胞增殖与迁移，诱导间质-上皮转化（MET），并降低转移起始细胞（MIC）特征，包括侵袭性癌症干细胞（CD44^high/CD24^low）、持久性癌细胞（p65、FOXQ1、NRF2、NNMT）及耐药标志物（ABCB5、SNAIL、ALDH1）。体内实验表明，paxalisib克服免疫治疗抵抗，降低原发肿瘤负荷、循环肿瘤细胞（CTC）及转移指标，且毒性可控。基因表达与空间分析显示，paxalisib深刻影响肿瘤免疫微环境，减少与免疫治疗抵抗相关的适应性免疫表型（耗竭T细胞、调节性T细胞）及促肿瘤先天免疫细胞（如肥大细胞）。PI3K–mTOR阻断作用于EZH2上游，影响经典抑制性催化轴（p85β–EZH2–H3K27Me3）和活性轴（EZH2–NF-κB）。研究提示双重靶向PI3K–mTOR通路可协同破坏EZH2的双重功能，抑制转移并增强癌症免疫可见性。

引言

乳腺癌是全球女性最常见癌症，其中TNBC占15%–20%，缺乏雌激素受体、孕激素受体及HER2表达，治疗选择有限。TNBC侵袭性强，近50%患者发生脑、肝、肺远处转移，中位生存期仅13个月。化疗响应短暂，免疫化疗虽改善II–III期TNBC生存，但转移背景下免疫治疗响应有限且限于PDL1高表达患者。PI3K信号在肿瘤发生与免疫中起核心作用，但泛PI3K抑制剂毒性高，亚型选择性抑制剂效果不一。PI3Kα抑制剂alpelisib联合fulvestrant在转移性乳腺癌中显示有限疗效，但不良反应常见。双效抑制剂paxalisib可穿透血脑屏障，在胶质母细胞瘤、脑转移实体瘤、DIPG/DMG及原发性中枢神经系统淋巴瘤中展现临床潜力。尽管PI3K通路单个基因突变罕见，但PIK3CA、AKT1激活突变与PTEN失活突变共存时，25%–30%晚期TNBC存在通路激活。因此，在免疫治疗时代重新审视PI3K通路抑制对TNBC联合治疗具有重要意义。

材料与方法

研究使用4T1（小鼠转移性TNBC）、MDA-MB-231、MDA-MB-468、SUM149PT（人TNBC）细胞系，经Mycoplasma检测和STR认证。细胞培养采用DMEM或RPMI 1640培养基。PI3K–mTOR抑制剂（如paxalisib、dactolisib等）来源于Selleck Chemicals或Kazia Therapeutics。细胞活力通过WST-1法检测，迁移通过划痕愈合实验评估。流式细胞术分析CD44^high/CD24^low群体。RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR分析基因表达。人类研究经伦理委员会批准，患者知情同意。外周血单核细胞（PBMC）和CTC通过RosetteSep或ScreenCell技术富集。组织化学、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）及Duolink邻位连接技术（PLA）用于蛋白互作分析。动物实验使用BALB/c小鼠，建立原位乳腺肿瘤模型、静脉转移模型及结肠腺癌“热”肿瘤模型。肿瘤消化、NanoString nCounter分析、空间免疫 profiling及生物信息学分析用于微环境解析。统计学分析采用Prism 10软件，P ≤ 0.05为显著。

结果

双效PI3K–mTOR阻断抑制增殖、迁移并诱导MET

双效抑制剂（paxalisib、omipalisib等）在TNBC细胞中IC₅₀ ≤ 2.5 μmol/L，显著抑制增殖与迁移。Paxalisib处理降低间质标志物vimentin，增加上皮标志物E-cadherin，减少CD44/CD24比率（67%），并下调ABCB5、ALDH1、Snail等耐药标志物及NF-κB p65、FOXQ1等持久性细胞标记。在患者来源CTC中，paxalisib降低IL-6表达（72%），并诱导病毒模拟签名（如GBP2上调）。

Paxalisib降低原发肿瘤负荷与转移

在4T1模型中，paxalisib（7.5 mg/kg）与抗PD1联合显著降低肿瘤体积与重量，且无毒性增加。三联方案（paxalisib + anti-PD1 + Abraxane）效果最佳。组织病理显示肺白细胞浸润减少，脾髓外造血抑制。静脉注射模型证实paxalisib减少CTC数量及肺转移结节（大突起与小扁平结节）。

空间成像揭示免疫微环境重塑

CODEX多重成像显示paxalisib + anti-PD1处理降低基质细胞比例，增加B细胞、中性粒细胞、树突状细胞，减少巨噬细胞。细胞邻域分析发现B细胞与中性粒细胞向肿瘤中心聚集，树突状细胞位于外周，巨噬细胞（中央）与基质细胞减少。NanoString分析证实细胞毒性T细胞功能增强（颗粒酶B、IFNγ上调），肥大细胞、Treg减少。

PI3K–mTOR抑制靶向p85β:H3K27Me3转换

IHC证实TNBC患者组织中核p85β表达。Paxalisib处理降低核p85β与H3K27Me3表达，破坏p85β:EZH2及NF-κB:EZH2互作。ChIP-seq显示EZH2结合基因启动子或远端区域，与NF-κB共定位（如IL-6、FOXQ1启动子）。化疗后患者PBMC中p85β–H3K27Me3互作增强，提示耐药关联。

PIK3R2表达与生存关联

基底样/TNBC中高PIK3R2表达与较差无远处转移生存相关。转移性TNBC化疗后高PIK3R2 mRNA预示不良总生存。新辅助化疗后残留肿瘤中高PIK3R2与远处复发正相关。

讨论

本研究阐明PI3K–mTOR双重抑制通过靶向MIC群体（CSC、持久细胞）、抑制炎症（如IL-6）并激活病毒模拟签名，增强免疫可见性。同时，paxalisib破坏核p85β–EZH2复合物，抑制EZH2双重功能（催化抑制与非催化激活），克服耐药机制。PIK3R2作为预后生物标志物，为精准医疗提供依据。该策略为TNBC免疫联合治疗开辟新途径。