对卡纳塔克邦反刍动物炭疽疫情中分离出的炭疽杆菌（Bacillus anthracis）进行的分子分析揭示了其遗传关系以及影响孢子存活的环境因素

《Research in Microbiology》：Molecular analysis of Bacillus anthracis isolates from Karnataka’s ruminant Anthrax outbreaks reveals genetic relationships and environmental factors Influencing spore persistence.

炭疽病在卡纳塔克邦的流行与土壤环境及分子分型相关研究，通过45例疑似动物病例的PCR检测和12处土壤样本的GABRI方法分析，发现本地化传播与土壤高碱性、有机质及黏土含量相关，rpoB基因分型显示近缘性，提出环境与动物活动共同影响疫情。

　　本研究聚焦于印度卡纳塔克邦地区，对炭疽病的流行情况、病原体特征以及环境因素进行了系统分析。炭疽病是一种由炭疽芽孢杆菌（*Bacillus anthracis*）引起的急性、高度致命的动物源性传染病，具有重要的公共卫生和兽医卫生意义。该病原体属于革兰氏阳性、形成芽孢、有荚膜但不运动的细菌，主要感染牲畜和野生动物，偶尔也会波及人类。炭疽病的临床表现包括急性败血症、突发死亡、鼻腔或其他自然孔口流出未凝固的黑色血液、不完全尸僵以及脾脏肿大等特征。这些症状在牲畜中尤为明显，尤其是在牛的感染病例中。

在印度，炭疽病仍然在多个地区流行，特别是在南部的卡纳塔克邦、安得拉邦、喀拉拉邦、泰米尔纳德邦和奥里萨邦等。这些地区不仅报告了频繁的牲畜感染病例，还存在人类感染的偶发情况。炭疽病的流行范围广泛，过去二十年中，印度18个州都曾出现该病，其中南部和东部地区受影响最为严重。1990年代炭疽病的爆发率显著上升，2000年至2002年间达到顶峰，随后逐渐下降。根据印度农业畜牧业、乳制品和渔业部（DAFD）2013年的年度报告，仅2011年至2012年期间，全国就记录了48次炭疽病爆发，造成323头牲畜死亡。在人类病例中，奥里萨邦和安得拉邦的感染情况尤为突出，奥里萨邦在2002年至2021年间报告了1208例病例和436例死亡，反映出36%的病死率。在印度的牲畜疾病中，炭疽病的病死率最高，可达60%，对每年的牲畜损失贡献了约1.3%。

尽管已有多种疫苗可用于预防炭疽病，卡纳塔克邦仍然被认为是高发地区之一。因此，该地区需要持续的监测、及时的疫苗接种、农民的培训与意识提升，以及合理的尸体处理方法。炭疽病的流行不仅影响牲畜的健康，还对当地经济造成巨大负担，包括高死亡率、牲畜生产力下降以及牲畜及相关产品的贸易限制。

炭疽芽孢杆菌在遗传上与枯草芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）和苏云金芽孢杆菌（*Bacillus thuringiensis*）非常相似，被认为是通过获得两个毒力质粒——pXO1和pXO2——从枯草芽孢杆菌进化而来。pXO1质粒编码毒素基因，包括保护抗原（pag）、水肿因子（cya）和致死因子（lef），而pXO2质粒则包含荚膜形成相关基因（capA、capB、capC）。这些质粒在炭疽芽孢杆菌的致病性中起着关键作用。pXO2质粒指导合成多聚-γ-D-谷氨酸荚膜，这有助于细菌在宿主体内存活，并避免被吞噬。此外，染色体上的*rpoB*基因编码RNA聚合酶的β亚基，是用于物种层面鉴定的稳定分子标记。

为了提高炭疽芽孢杆菌的检测和鉴定准确性，研究人员开发了多种分子检测方法，包括针对毒力质粒和染色体标记的常规PCR检测、实时PCR检测以及多重PCR检测。实时PCR检测利用荧光共振能量转移（FRET）技术，可以快速、特异性地检测炭疽芽孢杆菌。多重PCR方法则可以同时检测染色体和质粒基因，从而提高区分炭疽芽孢杆菌与相近的枯草芽孢杆菌属物种的准确性。此外，全基因组测序（WGS）技术进一步推动了分子流行病学的发展，使研究人员能够进行系统进化分析、详细研究毒力基因、抗菌药物耐药性标记以及病原体之间的进化关系。

本研究旨在通过综合方法，对卡纳塔克邦地区的炭疽病爆发进行调查，确认炭疽芽孢杆菌的分离和鉴定，并进行分子特征分析。同时，研究还试图通过分析环境中的土壤样本，了解炭疽病在该地区反复爆发的生态因素。研究团队从12个不同地点（6个高发地区和6个非高发地区）采集了土壤样本，并采用改进的分离方法，以提高炭疽芽孢杆菌的检测效率，减少环境污染物对芽孢萌发和生长的干扰。

在对45例疑似动物炭疽病例的调查中，研究团队通过培养和PCR方法确认了9例炭疽芽孢杆菌的感染。这些分离株在血琼脂平板上呈现出典型的“Medusa head”（海葵头）状菌落，进一步通过PCR检测目标基因（保护抗原、荚膜基因和*rpoB*基因）进行验证。PCR结果表明，这些分离株在*rpoB*基因的系统进化分析中表现出紧密的遗传关系，说明其传播可能是局部性的，且可能受到动物迁徙的影响。

土壤分析结果显示，高发地区的土壤pH值偏碱性（7.81至8.9），有机碳含量较高（0.45至4.36%），磷含量也显著增加（10.32至123.7 Kg/ha），且黏土含量高达45%（特别是在贝尔拉里地区）。这些条件有助于炭疽芽孢杆菌的存活和滞留，从而增加其在高发地区的传播风险。相比之下，非高发地区的土壤pH值接近中性或略微酸性（6.1至6.85），磷含量较低，土壤质地为砂质黏土壤土，这些特征可能限制炭疽芽孢杆菌的长期滞留。

本研究的结果揭示了环境和遗传因素在炭疽芽孢杆菌存活和传播中的重要作用。土壤在炭疽病的流行中扮演了关键角色，高发地区的土壤条件更有利于芽孢的存活和传播。此外，分离株之间的紧密遗传关系进一步表明，炭疽病的传播可能受到局部因素的影响，尤其是动物迁徙。这些发现强调了在高发地区进行持续监测和预防措施的重要性，以减少炭疽病的爆发风险。

研究团队还采用了一系列实验材料和试剂，包括营养琼脂、BHI培养基、PLET琼脂（含多粘菌素、溶菌酶、EDTA和硫代乙酰胺的培养基），以及用于革兰氏和麦克法迪恩染色的试剂，均来自印度孟买HiMedia公司。DNA提取使用了Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit，PCR扩增则使用了Denmark的Ampliqon 2X PCR Master Mix以及定制合成的引物（见表1），由印度班加罗尔的Eurofins公司提供。用于凝胶电泳的SeaKem LE琼脂和1X TBE缓冲液也来自HiMedia公司。

在培养研究中，研究人员从死亡动物的样本中分离出炭疽芽孢杆菌，这些样本在BHI培养基上表现出典型的菌落和细胞形态。经过17至24小时的37°C培养后，所有9个分离株形成了白色、较平、中等大小的菌落，边缘呈卷曲状。革兰氏染色结果显示，这些菌落为革兰氏阳性，呈方形末端的杆菌，排列成短链或长链，呈现出独特的“竹节杆”、“箱形杆”或“火车车厢”状结构。直接观察耳部和血液样本进一步验证了炭疽芽孢杆菌的感染情况。

此外，研究团队还通过结合培养特征、革兰氏染色和多色美蓝染色确认了炭疽芽孢杆菌的鉴定。这些菌落为“箱形杆”状，排列成短链，是区分炭疽芽孢杆菌与其他芽孢杆菌属物种的关键特征。由于胆盐的抑制作用，这些菌株在麦康凯培养基上无法生长，而在血琼脂平板上则不产生溶血现象，这进一步确认了炭疽芽孢杆菌的存在。不溶血的表型与该菌株缺乏某些溶血相关特征一致。

本研究的结论表明，炭疽芽孢杆菌在卡纳塔克邦地区的流行受到环境因素和动物迁徙的影响，而非病原体本身的进化。培养和分子诊断方法能够可靠地识别炭疽芽孢杆菌，通过PCR扩增相关基因可以提高检测的准确性和特异性。研究团队的综合方法，包括微生物学、分子生物学、系统进化分析和环境分析，为理解炭疽病的流行机制提供了新的视角。此外，研究还强调了在高发地区进行系统监测和预防措施的重要性，以减少炭疽病的传播风险并保护人类和动物健康。

研究团队还特别感谢了印度卡纳塔克邦政府农业畜牧业与兽医服务部（AH&VS）在样本收集方面的支持。此外，特别感谢SRDDL（农业畜牧业与兽医生物制品研究所）、IAH&VB/KVAFSU（卡纳塔克邦农业畜牧业与兽医生物制品研究所）以及印度科技部（DBT）提供的资金支持和实验室设施，这些资源对于本研究的顺利完成至关重要。研究团队的成果不仅有助于深入了解炭疽病的流行机制，还为制定有效的预防和控制策略提供了科学依据。