孟德尔随机化法与脑脊液相关生物标志物的转录组分析在缺血性中风研究中的应用

《World Neurosurgery: X》：Mendelian Randomization and Transcriptome Analysis of Cerebrospinal Fluid-related Biomarkers for Ischemic Stroke

CSF相关生物标志物CDH7、MGAT4C、ITPKC通过整合孟德尔随机化与转录组学分析鉴定，验证其在缺血性卒中（IS）中的因果关联及表达特征，并发现Genistein和Pioglitazone等潜在治疗药物。

　　这项研究通过整合孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）和转录组学分析，探索了脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）相关蛋白与缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）之间的因果关系，并筛选出具有潜在诊断和治疗价值的生物标志物。脑卒中作为全球范围内的主要致残和致死原因之一，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子过程。尽管已有大量研究关注脑组织和血液中的生物标志物，但CSF在IS中的作用尚未被充分探索。CSF直接接触大脑和脊髓，是神经信号传递、废物清除和神经保护的重要介质，因此其蛋白成分可能成为研究IS的重要资源。

### 研究方法与流程

研究采用了一种系统性的多步骤分析策略，以确保结果的可靠性和科学性。首先，通过MR方法识别与IS存在因果关系的CSF相关蛋白基因。MR是一种利用遗传变异作为工具变量的统计学方法，旨在减少传统观察性研究中可能存在的混杂因素和反向因果关系的影响。研究团队从GWAS数据库中获取了与CSF蛋白相关的暴露因素数据，并从IEU OpenGWAS数据库中获取了IS相关的表型数据。通过严格的筛选标准，包括遗传变异与暴露因素之间的显著关联（p值 < 5×10^-6）以及F统计量 > 10，确保所选的遗传变异具有足够的解释力和独立性。

在MR分析中，采用了多种方法进行因果效应评估，包括MR Egger、加权中位数（Weighted Median）、逆方差加权（Inverse Variance Weighted, IVW）、简单模式（Simple Mode）和加权模式（Weighted Mode）。其中，IVW方法作为主要分析手段，其假设是水平多效性（horizontal pleiotropy）的影响平均为零。通过Cochran’s Q统计量检测异质性，并使用随机效应模型进行校正，从而获得更为稳健的因果效应估计。此外，为了验证分析结果的稳健性，还进行了敏感性分析，包括水平多效性测试、异质性测试以及留一法（Leave-One-Out, LOO）分析。所有这些分析共同确保了因果关系推断的准确性，避免了因单一变量或潜在偏差导致的误判。

接下来，研究团队利用转录组学数据进一步筛选与IS相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。他们从GEO数据库中获取了两个微阵列数据集（GSE268634和GSE262257），分别用于训练和验证。通过DESeq2工具，对两组数据进行差异表达分析，识别出4,144个DEGs，其中2,493个基因在疾病组中表达下调，1,651个基因在疾病组中表达上调。随后，研究团队通过Venn图筛选出同时出现在MR基因（MRGs）和DEGs中的46个基因，这些基因被认为是与IS相关的候选基因。

为了进一步精炼候选基因，研究团队采用了机器学习方法，包括LASSO回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）。通过这两种算法，研究团队从46个候选基因中筛选出6个关键基因，并利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC）评估其诊断价值。结果显示，CDH7、MGAT4C和ITPKC在训练集和验证集中均表现出较高的AUC值（>0.7），表明其在IS诊断中具有较高的准确性。此外，通过t检验进一步验证了这些基因在IS患者和健康对照组中的表达差异，证实其在疾病状态下的显著变化。

### 生物标志物的分子机制与功能分析

为了深入理解这些候选基因在IS中的作用，研究团队进行了功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建。功能富集分析显示，这些基因主要参与细胞粘附、免疫调节和信号转导等生物学过程。其中，GO分析揭示了这些基因在细胞基质粘附、细胞-基质粘附、纤维蛋白溶解负调控、含胶原的细胞外基质、细胞膜外侧、内质网腔、整合素结合等通路中的显著富集。KEGG通路分析进一步表明，这些基因与Th17细胞分化、Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）信号通路以及RIG-I样受体通路密切相关，这些通路在免疫调节和炎症反应中起着重要作用。

PPI网络分析则揭示了这些基因在细胞和分子层面的相互作用关系。结果显示，TLR1是该网络的核心节点，具有最多的连接，而CD86和CSF3也表现出较强的相互作用。这表明这些基因可能在免疫反应和炎症调控中扮演关键角色。此外，通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），研究团队进一步探讨了这些基因与特定生物学通路之间的关联。CDH7和MGAT4C与钙信号通路呈正相关，而与炎症相关通路呈负相关，提示它们可能在钙信号调节和神经元修复过程中发挥重要作用。相比之下，ITPKC则与钙信号通路呈负相关，而与蛋白降解和生物合成相关通路呈正相关，表明其可能在抑制炎症反应和恢复细胞稳态方面具有潜在功能。

免疫浸润分析进一步揭示了IS与健康对照组在免疫细胞组成上的显著差异。研究团队利用CIBERSORT算法对两种样本类型中的28种免疫细胞类型进行了比较分析，发现其中22种免疫细胞在IS组中表现出显著的表达变化。具体而言，激活的B细胞和CD4+ T细胞在IS组中相对减少，而自然杀伤细胞和Th1细胞则相对增加。这表明IS的发展过程中存在显著的免疫反应变化，特别是炎症性免疫细胞的激活。进一步的关联分析显示，ITPKC的表达与有益的免疫细胞呈正相关，而CDH7和MGAT4C的表达则与这些细胞呈负相关，提示ITPKC可能具有抗炎作用，而CDH7和MGAT4C可能在炎症反应中起促进作用。

### 生物标志物的实验验证

为了验证这些候选基因在IS中的表达变化，研究团队在MCAO/R大鼠模型中进行了实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）和免疫组织化学（immunohistochemistry）实验。实验结果显示，CDH7和MGAT4C在MCAO/R大鼠的脑皮层中显著上调，而ITPKC则显著下调。这些结果与转录组学分析和MR结果一致，进一步支持了这些基因在IS中的潜在作用。

此外，研究团队还利用DSigDB数据库预测了这些生物标志物可能的靶向药物。结果显示，Genistein和Pioglitazone等化合物可能通过减轻氧化应激和炎症反应，对IS具有神经保护作用。这些药物的预测结果与实验验证数据相互印证，表明这些生物标志物不仅具有诊断价值，还可能成为未来IS治疗的潜在靶点。

### 研究意义与未来方向

这项研究的发现为IS的分子机制提供了新的视角，并为早期诊断和靶向治疗策略的开发奠定了基础。CDH7、MGAT4C和ITPKC作为CSF来源的生物标志物，其在IS中的因果作用和表达变化为相关研究提供了重要的参考依据。特别是，这些基因与钙信号通路、免疫调节以及细胞外基质重塑等关键通路的关联，进一步揭示了IS发生发展的复杂机制。

然而，研究也存在一定的局限性。首先，其主要依赖于公共数据库中的生物信息学分析，缺乏直接的临床验证。其次，研究使用的动物模型为年轻大鼠，这可能限制了研究结果在老年患者中的适用性。最后，由于未能获取人类CSF样本，研究团队无法直接验证这些基因在人体中的表达变化和功能作用。因此，未来的研究需要进一步结合临床样本和多组学数据，以更全面地揭示这些生物标志物在IS中的作用，并探索其在临床中的应用潜力。

### 结论

综上所述，这项研究通过整合MR、转录组学、机器学习和动物实验，成功识别了CDH7、MGAT4C和ITPKC作为IS的潜在生物标志物。这些基因不仅在IS的病理过程中表现出显著的表达变化，还与多种关键生物学通路存在关联，提示其可能在神经元损伤、炎症反应和细胞修复等过程中发挥重要作用。研究团队还预测了这些基因可能的靶向药物，为IS的治疗提供了新的思路。尽管研究存在一定的局限性，但其结果为IS的分子机制研究和生物标志物开发提供了重要的科学依据，并为进一步的临床转化研究奠定了基础。未来的研究应致力于在更大规模的临床样本中验证这些发现，并探索其在不同人群中的适用性，以推动IS的精准诊断和个体化治疗策略的发展。