ZBP1介导心肌细胞PANoptosis：缺血再灌注损伤的新机制与靶向治疗策略

本研究发现Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）通过形成ZBP1/RIPK3/CASP8/CASP6复合体驱动心肌细胞PANoptosis（一种同时包含焦亡、凋亡和坏死性凋亡的程序性细胞死亡），是心肌缺血再灌注（I/R）损伤的关键机制。研究通过体内外模型证实ZBP1缺失可显著减轻心肌损伤，而特异性过表达则直接诱发心衰。研究者还通过虚拟筛选发现新型小分子化合物MSB能高效结合ZBP1并抑制PANoptosome组装，为临床防治I/R损伤提供了新靶点。

　　

引言

心肌梗死是全球发病和死亡的主要原因，再灌注治疗虽能恢复缺血组织血供，但再灌注过程本身可能引发额外心肌细胞死亡，即心肌缺血再灌注（I/R）损伤。过度的心肌细胞死亡是I/R损伤的核心病理特征，不仅增加急性期梗死面积，还导致长期心脏重构和心力衰竭。除经典的凋亡和坏死外，新调控性细胞死亡方式如坏死性凋亡、焦亡和铁死亡也被发现参与心血管疾病。然而这些死亡方式在I/R损伤中的相互作用机制尚不明确。PANoptosis作为一种高度协调的细胞死亡过程，同时具备焦亡、凋亡和坏死性凋亡的分子特征，由PANoptosome复合体调控。ZDNA结合蛋白1（ZBP1）是先天免疫传感器，能激活炎症和多种细胞死亡通路，但其在成年心肌细胞中的作用尚未探索。

整合生物信息学分析揭示ZBP1在心肌I/R损伤中的关键作用

通过时间序列RNA测序分析I/R不同阶段小鼠心肌样本，发现再灌注阶段显著富集细胞死亡相关基因簇，其中ZBP1在鼠类I/R模型和人类缺血性心肌病数据集均呈现显著表达变化。qPCR、Western blot和免疫组化证实I/R后心肌ZBP1表达上调。进一步细胞分型显示心肌细胞是I/R后ZBP1表达的主要细胞类型，而成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞无显著变化。

Zbp1缺失减轻H/R应激诱导的心肌细胞多种死亡方式

体外缺氧/复氧（H/R）模型模拟I/R损伤，发现ZBP1表达随时间推移持续上调。利用他莫昔芬诱导的心肌细胞特异性Zbp1敲除小鼠（Zbp1^fl/flMyh6⁺）证实，ZBP1缺失显著抑制H/R诱导的焦亡（GSDMD活化）、凋亡（caspase-3剪切）和坏死性凋亡（RIPK3磷酸化）标志物表达，减少PI阳性细胞和LDH释放，降低caspase-3活性。值得注意的是，ZBP1缺失并不影响cGAS-STING信号通路、IFN-I反应或NFκB信号激活，表明ZBP1驱动的心肌细胞死亡独立于炎症反应。

靶向ZBP1保护人iPSC来源心肌细胞抵抗H/R应激

在人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）中验证ZBP1功能，发现H/R后ZBP1同样上调。敲低ZBP1可减少PI阳性细胞、LDH释放和caspase-3活性，证实其在人类心肌细胞中的保护作用。

心肌细胞特异性Zbp1缺失减轻体内I/R诱导的PANoptosis

小鼠I/R模型显示，虽然细胞死亡抑制剂GSK’872（坏死性凋亡抑制剂）和zVAD（凋亡/焦亡抑制剂）能减小梗死面积，但Zbp1缺失效果更显著。Zbp1缺失小鼠表现为更少的Evans蓝染料（EBD）摄取和TUNEL阳性细胞，Western blot显示caspase-3、RIPK3和GSDMD活化被抑制。长期随访发现Zbp1敲除改善心功能（LVEF升高、LVID减小），减少心脏纤维化和心衰标志物BNP、胶原蛋白I表达。髓系特异性Zbp1敲除并不影响梗死面积，表明ZBP1的作用主要源于心肌细胞自身。

心肌细胞特异性过表达Zbp1直接诱导心脏重构和心衰

构建心肌细胞特异性Zbp1过表达小鼠（Zbp1^TGMyh6⁺），发现过表达ZBP1直接导致心脏功能恶化（LVEF降低、LVID增大），心重/体重比和肺重/胫骨长度比增加，Masson染色显示胶原沉积增多，EBD和TUNEL阳性细胞增加。分子水平显示BNP、MYH7和胶原蛋白I上调。RNAseq分析提示过表达主要激活细胞死亡相关通路而非炎症通路。Western blot证实RIPK3、caspase-3和GSDMD活化增强，caspase-8而非RIPK1参与该过程。

ZBP1通过调控非经典PANoptosome组装诱导心肌细胞PANoptosis

免疫共沉淀显示ZBP1过表达促进其与RIPK3、CASP8、CASP6相互作用，但不与RIPK1、NLRP3或ASC结合。cGAS缺失不影响复合体形成。RIPK3和CASP6作为诱饵蛋白进一步确认了这些相互作用。免疫荧光显示ZBP1与RIPK3、CASP8、CASP6共定位。在H/R应激下，Zbp1缺失破坏RIPK3与CASP8/CASP6的相互作用。敲低RIPK3或CASP6 disrupts ZBP1复合体形成，而CASP8敲低仅影响自身招募。ZBP1还增强RIPK3与CaMKII的相互作用并促进其磷酸化。

细胞死亡抑制剂 ameliorate Zbp1过表达诱导的心脏重构

用Nec-1、GSK’872、zVAD处理Zbp1过表达小鼠，发现GSK’872+zVAD联合治疗最显著改善心功能、减轻纤维化和细胞死亡，而Nec-1无效。所有抑制剂均降低ISGs表达，提示炎症反应是细胞死亡的次级效应。

MSB作为新型ZBP1抑制剂抵抗心肌I/R损伤

通过虚拟筛选靶向ZBP1 RHIM结构域的小分子化合物，发现MSB与ZBP1具有高亲和力（K_D=725 nM）。MSB处理 disrupts ZBP1与RIPK3、CASP8、CASP6的相互作用。体外实验显示MSB减轻H/R诱导的细胞死亡。体内实验证实MSB减小梗死面积、降低LDH释放和TUNEL阳性细胞，改善心功能并减轻纤维化。

讨论

本研究首次揭示ZBP1在成年心肌细胞I/R损伤中诱导PANoptosis的关键作用。ZBP1通过形成ZBP1/RIPK3/CASP8/CASP6复合体驱动多重细胞死亡，而不依赖于核酸配体或经典炎症通路。与传统细胞死亡抑制剂相比，靶向ZBP1能更有效地保护心脏。发现的ZBP1抑制剂MSB为临床治疗提供了新策略。该研究深化了对心肌细胞死亡机制的理解，为I/R损伤防治开辟了新方向。