通过多价调控血脑屏障转运实现快速Aβ清除与认知功能恢复的新策略

本综述揭示了一种靶向血脑屏障（BBB）低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）的创新治疗策略。通过设计具有精确尺寸和多价特性的LRP1靶向聚合物囊泡（A40-POs），成功调控受体介导的转运过程，促进跨细胞作用（transcytosis）并上调LRP1表达，从而显著提升Aβ清除效率。在AD模型小鼠中，该干预使脑内Aβ水平在2小时内降低近45%，血浆Aβ水平增加8倍，并实现长达6个月的认知功能恢复。这项工作开创了利用纳米医学超分子特性调控膜运输水平的药物设计新范式，为阿尔茨海默病治疗提供了变革性基础。

　　

引言

阿尔茨海默病（AD）占痴呆病例的近70%，其病理特征表现为淀粉样蛋白β（Aβ）在纤维和斑块中的积累，随后是另一种蛋白tau的超磷酸化、错误折叠和聚集成神经原纤维缠结。这两种聚集体都与强烈的炎症反应、突触功能障碍和神经元损伤相关，导致显著的脑损伤和认知过程受损。此外，被称为血脑屏障（BBB）的脑血管网络在AD进展和可能的发生中扮演关键角色。

BBB由排列整齐的内皮细胞组成，由周细胞和星形胶质细胞支持，形成体内最密集的血管网络，大约每个神经元对应一个毛细血管。越来越多的证据表明，BBB功能障碍通过相互关联的病理级联反应主动驱动AD发病机制：血管周围Aβ沉积逐渐积累，而低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）定位从内皮细胞转移到周细胞，这种细胞特异性重新分布显著损害Aβ清除能力并促进神经血管解耦发病机制。

LRP1介导的运输遵循不同的路线，受货物-受体相互作用的亲合力影响。高亲合力结合促进受体聚类和磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白（PICALM）的招募，触发网格蛋白介导的内吞作用和Rab5依赖的早期内体分选。该途径经常导致溶酶体降解，从而减少可用于进一步运输的膜结合LRP1池。中等亲合力货物则与PACSIN2（也称为syndapin-2）结合，这是一种F-BAR膜塑形蛋白，产生并稳定连接管腔和腔外膜的管状载体。这种非经典跨细胞途径绕过降解性内体-溶酶体系统，实现LRP1货物快速、无降解地递送到脑实质，或在流出的情况下进入循环。

货物亲合力也影响LRP1表达水平。中等亲合力配体促进PACSIN2依赖性穿梭，这与持续甚至升高的LRP1表达相关，可能是因为受体免于降解。相比之下，高亲合力配体使运输偏向Rab5富集的内体和溶酶体处理，导致LRP1下调。我们提出LRP1稳态反映了受体合成和降解之间的动态平衡，其中一部分LRP1通常通过PACSIN2载体在BBB上循环。新货物可以破坏这种平衡；高亲合力将平衡转向降解，降低受体水平，而中等亲合力支持有效的穿梭和受体保存。

结果

为了充分理解BBB LRP1在介导Aβ运输中的作用，我们在APP/PS1和野生型动物中跟踪其表达以及其他标志物和Aβ。我们进行了多层次的比较研究，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量和原位成像模式。这种集成方法有助于全脑分析结合系统评估分离的血管-实质。

我们使用共聚焦显微镜评估了3个月和12个月大AD脑样本中LRP1和Aβ在BBB内皮细胞（CD31）和周细胞（CD146）的空间定位。在3个月大的样本中，Aβ与内皮细胞上的LRP1高度共定位，表明在较年轻年龄时LRP1积极参与Aβ运输和清除，血管周围Aβ积累较少。12个月大的大脑显示，BBB血管基底侧Aβ沉积显著增加，LRP1与Aβ的共定位似乎减少，表明随着AD进展，LRP1介导的Aβ清除受损。

我们收集了3-12个月寿命的AD和野生型小鼠的大脑，并将其分馏为实质和血管。我们通过ELISA测量了Aβ、LRP1、PACSIN2和Rab5水平。数据显示，野生型小鼠血管中Aβ显著更多，在所有寿命阶段与APP/PS1小鼠相比出现显著差异，证明了AD的病理特征。这些差异对应于实质中Aβ水平的增加。

我们制备并表征了P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀与angiopep2-P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀混合，制成每个颗粒带有40个配体的聚合物囊泡。这些聚合物囊泡被称为A₄₀-POs。

APP/PS1转基因AD小鼠静脉注射200μL A₄₀-POs以及四种对照处理：假制剂（仅PBS）、单独angiopep-2（A₁）、原始P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀聚合物囊泡（A₀-POs）和带有200个angiopep-2配体的聚合物囊泡（A₂₀₀-POs）。给药两小时后，处死动物，通过ELISA测量大脑和血浆中的Aβ水平。结果显示只有A₄₀-POs治疗有显著效果，脑Aβ减少近50%，从8603.6降至4236.3 ng ml^?1，血浆中 mirrored 增加8倍，从85.3增至673.5 ng ml^?1。

我们采用正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）评估活体动物大脑中Aβ的清除情况。动物注射了[¹⁸F] AV-45，一种已建立的Aβ标记物。PET-CT显示，12个月大的APP/PS1小鼠大脑表现出强烈的Aβ信号。相比之下，A₄₀-POs治疗后该信号急剧下降。A₄₀-POs给药12小时后，与Aβ相关的[¹⁸F] AV-45标准化摄取值减少46.25%。

这些发现促使我们研究A₄₀-PO治疗后BBB血管表型。我们首先观察到治疗大脑中LRP1与CD31的共定位增加，重叠恢复到野生型状态。Aβ分布的定量分析显示治疗后大脑血管中显著增加，与实质Aβ沉积逐渐减少形成对比。随后的ELISA测试检测了血管和实质中的各种蛋白质，包括LRP1、PACSIN2和Rab5。纳米药物清除了Aβ，并通过上调PACSIN2和下调Rab5引起BBB表型的快速变化。

最后，我们通过莫里斯水迷宫研究了A₄₀-POs给药对动物认知的影响。实验表明，随着实验天数的增加，动物找到平台所需的时间逐渐减少，表明动物在学习和记忆平台位置方面取得进展。A₄₀-POs治疗组在训练后表现出比假手术APP/PS1组显著更短的逃避路径长度，表明空间导航策略改善。它们的搜索效率与野生型小鼠相似。

讨论

晚期AD的深刻治疗顽固性源于神经病理学紊乱的自我强化级联：Aβ持续积累、BBB逐渐崩溃、生理清除路线崩溃以及多种神经退行性机制的汇聚，使疾病状态根深蒂固。在经典的APP/PS1小鼠模型中，12个月大时，血管周围淀粉样蛋白沉积与LRP1-内皮共定位显著减少同时积累，标志着神经血管单元的解耦和Aβ流出能力的侵蚀。

目前的治疗方法通常专注于通过调整配体亲和力来提高运输效率，特别是在转铁蛋白受体靶向策略中，这些策略已经证明中等亲和力相互作用可以通过避免溶酶体路由和促进跨细胞作用而优于高亲和力结合。虽然这些策略开启了神经药物设计的新篇章，但它们大多仍以运输为中心，关注将分子送入大脑而非修复运输系统本身。

相比之下，这里提出的方法旨在纠正内皮运输的病理转变，重新建立受体回收和降解之间的健康平衡。我们的策略基于受体-配体结合热力学、超分子空间编码和膜运输动力学的基本生物物理原理。受体命运由结合能、空间限制和膜微区组织之间的精细平衡相互作用所控制：中等亲合力货物参与PACSIN2促进的管状载体，维持生理清除，而高亲合力配体促进Rab5介导的溶酶体降解，逐渐耗尽功能性受体。

我们的研究强调了多价靶向和BBB调控在治疗AD中的变革潜力。LRP1靶向聚合物囊泡的部署促进了快速Aβ清除并 initiated BBB的显著变化，导致改善的认知结果。这种创新的治疗范式为开发有效的临床干预、解决AD的血管贡献并最终改善患者 outcomes 提供了有希望的途径。

材料与方法

P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀和angiopep2-P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀共聚物通过原子转移自由基聚合（ATRP）合成。A₄₀-POs按照薄膜水化方法制备，其中P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀和1.88%摩尔比的angiopep2-P[(OEG)₁₀MA]₂₀-PDPA₁₂₀溶解在甲醇和氯仿混合物（v/v, 3:1）中。通过透射电子显微镜表征A₄₀-POs的形态，通过动态光散射评估直径分布。

所有动物研究均按照华西医院动物护理委员会（IACUC批准的项目编号：20211475A）制定的指南进行。石蜡包埋的小鼠脑组织切片（5μm）进行脱蜡和梯度酒精水化。通过ELISA测定各种蛋白质的浓度，包括LRP1、PACSIN2、Rab5和Aβ。

共聚焦图像使用Leica Stellaris 5共聚焦显微镜捕获。STED纳米镜实验在配备Leica TCS SP8 STED-ONE uni的Leica DMi8共聚焦显微镜下进行。使用酪胺信号放大（TSA）染色进行多重荧光染色。

APP/PS1 POs（12个月大）小鼠静脉注射商业Aβ放射对比剂[¹⁸F] AV-45（2.8-3.2 MBq）。然后通过微型PET-CT成像仪（Inviscan, France）根据操作规范获取小鼠颅内图像。

小鼠组织切片（5μm）进行脱蜡和再水化。使用CUBIC溶液进行组织透明化，然后通过Amira和iMaris软件分析图像。

使用Agilent-1260色谱仪在流速1 mL/min、柱温35°C、体积20μl、检测信号271 nm下检测多奈哌齐HCl的含量。

每组小鼠每天进行尾静脉注射（A₄₀-POs、donepezil@A₄₀-POs、donepezil或生理盐水），持续三天。随后将小鼠饲养在标准饲养环境中七天以适应和恢复。

在阶段IV和阶段VI结束时，测试假手术组、APP/PS1组和APP/PS1 POs组的蔗糖偏好。嵌套构建测试在蔗糖偏好实验后三天进行。

通过Jess自动化数字系统（ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA）进行蛋白质免疫印迹分析，使用12-230 kDa分离模块。使用Duolink? PLA Kit（Sigma??Aldrich; DUO96000和DUO96040）进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。