HCS-3DX：AI驱动的单细胞分辨率三维类器官高通量筛选系统突破肿瘤研究瓶颈

为解决三维类器官（3D-oids）在药物筛选研究中存在的标准化难题，研究人员开发了HCS-3DX系统。该系统整合AI引导的SpheroidPicker样本筛选、定制化FEP箔片多孔板光片成像和BIAS软件分析，实现了单细胞级别的3D高通量筛选，显著提升肿瘤模型分析的准确性与效率，为个性化医疗提供新技术支撑。

　　

在生物医学研究领域，三维细胞培养模型（包括球体、类器官和组装体等，统称为3D-oids）正逐渐取代传统二维培养体系，因其能更好地模拟体内组织的复杂结构和生理功能。尤其在肿瘤研究和药物开发中，3D模型能更真实地反映肿瘤微环境、细胞间相互作用及药物渗透特性。然而，三维模型的高通量筛选（HCS）仍面临巨大挑战：包括样本形态异质性高、化合物渗透效率低、成像难度大以及数据分析复杂等问题。尽管自2010年以来已有近4万篇相关论文发表，但仅1%的研究涉及基于成像的高通量筛选，其中针对3D-oids的高内涵成像研究更是仅有76项。这表明当前技术尚无法满足大规模、标准化三维筛选的需求。

为此，研究人员在《Nature Communications》上发表了题为"HCS-3DX, a next-generation AI-driven automated 3D-oid high-content screening system"的研究论文，开发了一套整合人工智能、自动化操作和先进成像技术的全新解决方案——HCS-3DX系统。该系统能够实现对三维细胞模型的自动化筛选、高通量成像和单细胞水平分析，为肿瘤研究和药物筛选提供了革命性的工具。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先利用AI驱动的SpheroidPicker系统进行3D-oids的形态学筛选和自动化转移；其次开发了专为光片显微镜（LSFM）优化的氟化乙烯丙烯（FEP）箔片多孔板，大幅提升成像效率；最后通过自主开发的生物学图像分析软件（BIAS）进行三维图像处理和单细胞特征提取。实验验证使用了HeLa Kyoto人宫颈癌细胞单培养模型以及HeLa Kyoto与MRC-5人成纤维细胞共培养模型，所有样本均通过标准程序培养和固定处理。

结果一：HCS-3DX系统概念设计

HCS-3DX系统包含三个核心组件：AI驱动的微操作器用于3D-oids的智能筛选；定制化的HCS箔片多孔板优化成像过程；以及基于图像的AI软件实现单细胞数据分析。该系统 workflow 涵盖从3D细胞培养生成到最终特征提取的八个关键步骤，能够快速、自动地完成多个3D-oids的高通量成像，穿透深度可达350微米，兼容固定样本和光学透明样本。

结果二：二维特征变异性分析

通过比较不同放大倍数物镜（2.5倍至20倍）获取的二维形态特征，研究发现除体积估算（Volume 2D）差异达6.5%外，其他特征如直径、周长、面积等相对差异均小于5%。低倍物镜（2.5倍）因分辨率限制导致形状参数（圆形度、球度等）准确性下降，而20倍物镜虽然分辨率最高，但采样时间较长。10倍物镜在成像速度和特征准确性间取得了最佳平衡。

结果三：球体模型变异性分析

比较三名专家生成的426个球体（223个单培养，203个共培养）发现，即使使用相同设备和协议，操作者间仍存在显著差异。单培养球体中，专家1生成的球体明显更大；共培养球体则显示出更高的变异性，其体积更小但结构更紧凑。通过圆形度与直径的相关性分析（单培养R_s=-0.69，共培养R_s=-0.54），可筛选出60.5%和55.1%的理想球体，表明特征选择对样本筛选至关重要。

结果四：优化HCS成像板设计

针对光片显微镜设计的FEP箔片多孔板显著提升了成像效率。与传统Petri皿方法相比，使用HCS板样本制备时间减少至14±2分钟（Petri皿需37±5分钟），总成像时间缩短至48±7分钟（Petri皿需102±9分钟），而图像质量无显著差异（通过强度方差度量验证）。该板支持直径350微米以下的固定或透明球体成像，兼容水浸物镜，并允许气体交换，适合长期活细胞成像。

结果五：二维与三维特征比较

分析110个单培养和114个共培养球体的三维特征发现，Solidity（紧实度）在二维和三维间相关性最高，而二维估算的体积显著小于三维测量值（单培养差异18.6%，共培养差异4%）。细胞数量与三维体积高度相关（单培养R_s=0.83，共培养R_s=0.90），但与二维面积相关性较弱，表明基于二维图像估算细胞数量准确性不足。

结果六：共培养球体模型的单细胞分析

对114个共培养球体的18,659个MRC-5细胞和13,353个HeLa Kyoto细胞进行单细胞分割和机器学习分类，发现63%球体以MRC-5细胞为主，25%以HeLa细胞为主，14%数量相等。HeLa细胞体积显著大于MRC-5细胞（约2倍），且细胞比例影响球体形态——HeLa为主的球体体积更小，但紧实度无显著差异。结构分析显示，规则球体通常形成成纤维细胞核心外包肿瘤细胞的结构，而不规则球体则呈现多核心分布。

讨论与结论

本研究开发的HCS-3DX系统成功解决了三维细胞模型高通量筛选中的关键难题，实现了从样本制备、智能筛选到高速成像和单细胞分析的全流程整合。系统采用AI驱动的SpheroidPicker确保样本形态均一性，定制化FEP多孔板提升成像效率，BIAS软件提供精准三维分析，显著增强了三维药物筛选的可靠性和通量。

研究发现，二维形态特征虽能部分反映三维特性，但对于不规则球体预测性有限，强调了三维修正的必要性。共培养模型显示细胞类型比例和空间分布显著影响球体特性，证明单细胞水平分析对理解肿瘤-基质相互作用至关重要。该系统为个性化医疗、药物发现和肿瘤生物学研究提供了强大工具，尤其适用于多细胞模型的高内涵筛选。

研究局限性包括当前模型仍较简化，未来需引入更多细胞类型和细胞外基质成分以更好模拟体内环境。此外，动态形态变化监测也有待加强。尽管如此，HCS-3DX系统的灵活性、高效性和准确性已为其在生物医学领域的广泛应用奠定坚实基础，将推动三维细胞研究向标准化、自动化方向发展。