基于自限域四面体DNA电路的可穿戴软生物电子器件实现慢性伤口的高保真监测

本研究针对当前伤口生物传感器在检测低丰度蛋白质时灵敏度不足、易受机械变形和生物污染影响等挑战，开发了一种嵌入自限域四面体DNA电路（SCTD）的柔性可穿戴生物电子系统。通过将DNA自循环扩增反应限制在亲水区域，检测限降低了一个数量级，同时四面体DNA结构提供了优异的机械稳定性（1000次弯曲后变化<3%）、长期稳定性（4周内信号衰减<8%）和抗生物污染能力（BSA吸附减少50%以上）。结合无线读出技术，该平台可同步监测多种伤口愈合相关蛋白（TNF-α、IL-6、TGF-β1和VEGF），在糖尿病小鼠模型中实现了对未感染和感染伤口的准确原位监测，为慢性伤口治疗提供了定量化评估工具。

　　

慢性伤口愈合是一个复杂的病理过程，涉及止血、炎症、增殖和重塑四个连续阶段，而慢性伤口往往长期停滞在促炎阶段无法正常愈合。目前临床伤口评估主要依靠视觉观察和经验判断，缺乏实时、客观的定量监测手段。虽然可穿戴伤口生物传感器的发展为连续监测提供了可能，但现有传感器主要检测温度、pH值等生物物理信号，对伤口愈合至关重要的蛋白质生物标志物检测仍面临重大挑战。

这些挑战主要体现在三个方面：首先，伤口愈合相关蛋白质含量极低，在软界面实现灵敏检测而无需额外操作或外部试剂触发十分困难；其次，伤口环境的复杂生物化学环境（如核酸酶）会导致传感元件降解，运动引起的变形会导致结构损伤，非特异性蛋白污染会降低传感保真度；最后，伤口对生物传感贴片提出了透气性、柔顺性和生物相容性的严格要求，贴片不应造成物理损伤或阻碍伤口愈合过程。

为了解决这些挑战，南京邮电大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新研究，开发了一种基于自限域四面体DNA电路（Self-Confined Tetrahedral DNA Circuit, SCTD）的透气软生物电子系统，用于全面监测伤口不同阶段的特异性蛋白质和生物物理指标。

研究团队采用了多项关键技术：使用静电纺丝聚丙烯腈/热塑性聚氨酯（PAN/TPU）纳米纤维作为基底确保透气性和柔软性；通过金电极阵列沉积和图案化润湿性处理构建亲水生物传感反应池；利用四面体DNA（TDNA）纳米结构实现稳定的生物分子识别；采用自限域DNA级联扩增策略实现无需外部试剂的自主扩增；集成无线柔性印刷电路板（FPCB）和智能手机用户界面实现实时数据传输。

表征纳米纤维基自限域DNA反应池

研究团队首先制备了TPU/PAN质量比为1:1的纳米纤维基底，其直径均匀为110纳米，具有多孔结构和交织纤维特征。

通过热蒸发沉积金电极阵列后，纳米纤维在2000次弯曲循环中电阻变化可忽略不计（<4%），循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）测量表明在1000次弯曲循环（弯曲半径：3厘米）后仍保持优异的电化学稳定性。纳米纤维基底的水蒸气透过率（WVTR）达到110g m^-2 h^-1，高于PDMS（41g m^-2 h^-1）和商业伤口敷料（91g m^-2 h^-1），满足人体皮肤的透气性要求。

通过疏水试剂和氧等离子体技术实现图案化润湿性，亲水区域接触角降至49°，而疏水区域保持107°。甲基橙水溶液可视化实验表明水滴选择性地润湿圆形和狐狸形状的亲水区域，在平坦和弯曲条件下均能保持良好定义的形状。荧光图像证实荧光标记的H1被限制在亲水区域内，确保生物传感扩增电路在生物传感池中运行。

验证四面体DNA信号放大电路的优势

与传统核酸扩增策略不同，SCTD策略采用自限域设计，扩增反应通过表面张力效应自主空间限制在指定的亲水区域内。在SCTD策略中，四面体支架在其顶端功能化了一个发夹DNA序列（H2），而修饰有亚甲基蓝（MB）的辅助发夹DNA（H1）作为干粉预涂在亲水传感区域。

当目标蛋白与H1结合后，构象变化暴露出互补序列，使其能够与H2杂交。信号放大机制在于设计的结合亲和力：H1-H2相互作用强于H1-目标结合，允许目标分子释放并参与多个反应循环。这种可循环的目标利用 dramatically 增强了信号产生，MB分子在约-0.28V处氧化，通过方波伏安法（SWV）进行电化学检测。

Native PAGE分析验证了TDNA的自组装。荧光和电化学测试进一步验证了SCTD策略，只有当H1、H2和目标同时存在时才会产生信号生成。与没有信号放大的传感器相比，采用信号放大的传感器对IL-6的检测响应更高，检测限（LOD）达到0.52ng mL^-1，比没有放大的传感器（4.26ng mL^-1）低一个数量级。

与传统适体（单链DNA）基生物传感元件相比，TDNA基生物传感元件在相同电极基底上表现出更优异的机械稳定性。ssDNA基传感器在弯曲1000次后峰值电流增加（增加比率：36%），而TDNA基传感器在弯曲1000次后保持稳定性（降低比率：2.7%）。TDNA结构传感TNF-α、IL-6、TGF-β1和VEGF时，在1000次弯曲循环下变化 within 3%，表明其适用于连续伤口监测。

在复杂流体中，TDNA固有的抗污染特性减少了牛血清白蛋白（BSA）的吸附。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像显示，与裸金电极和ssDNA修饰金电极相比，TDNA基金电极的BSA吸附显著减少。定量分析表明，TDNA修饰电极的BSA粘附率（6.9%）显著低于ssDNA基生物传感电极（26.2%）和裸Au电极（39.2%）。

考虑到伤口水环境中可能存在的核酸酶导致的DNA降解，研究人员通过长期稳定性测试研究了TDNA和ssDNA基传感器的抗降解能力。ssDNA基传感器在四周后信号增加868%，而TDNA基传感器在同一时期显示小于8%的信号衰减。

体外多路生物传感电子性能评估

为了检测低丰度伤口相关蛋白质，研究人员在生物传感电子器件上集成了SCTD策略。制造过程包括纳米纤维静电纺丝、金电极沉积、图案化润湿性处理、TDNA功能化和传感器阵列集成等顺序步骤。

将最佳量（10μL of 600nM）的TDNA通过Au-S形成固定在电极表面过夜，随后用10μL of 1mM MCH阻断电极表面的非活性位点，最后将最佳量（10μL of 1.5μM）的H1滴涂在MCH/TDNA/Au/纳米纤维电极上形成预涂H1干粉。

通过CV和EIS逐步验证了HI/MCH/TDNA/Au/纳米纤维生物传感电极的成功制备。CV曲线表明Au/纳米纤维电极具有最高的氧化还原峰值电流和最小的峰值电位差，表明电子转移速率加快。奈奎斯特图表明Au膜降低了电荷转移阻力，增强了电极界面的电子转移动力学。

在人工伤口液（AWF）中评估生化传感性能，传感器对TNF-α（10-5000pg mL^-1）、IL-6（1-100ng mL^-1）、TGF-β1（1-100pg mL^-1）和VEGF（0.05-20ng mL^-1）在临床显著浓度范围内呈现线性响应。传感器实现了令人印象深刻的分析性能，具有低LOD（TNF-α：3.67pg mL^-1，IL-6：0.52ng mL^-1，TGF-β1：0.41pg mL^-1，VEGF：6.3pg mL^-1）和高相关系数（R²>0.98）。与商业ELISA试剂盒相比，TNF-α检测显示出良好的相关性（R²=0.98）。

生物物理传感模块的表征

在伤口愈合过程中，温度和pH值也是重要的生物物理指标。伤口温度升高提示可能存在感染、炎症和愈合受损；而略酸性pH（4-6）促进胶原形成、成纤维细胞活性和抑制细菌生长，碱性pH（7-9）则表示愈合受损。

研究人员将温度和pH传感模块集成到传感平台中。聚苯胺（PANI）基pH传感器通过开路电位（OCP）变化进行测量，源于PANI表面质子化/去质子化。在pH4-10范围内，OCP随pH增加线性降低，灵敏度为-46mV pH^-1，在恒定pH下保持稳定。温度传感器采用蛇形结构的热响应电阻器设计，在35至45°C的生理相关范围内灵敏度为1.4Ω°C^-1。

生物相容性研究和小鼠模型中原位慢性伤口生物传感

在进行原位伤口检测前，对生物传感贴片的生物相容性和血液相容性进行了表征。与静电纺丝纤维基生物传感贴片共培养24小时后，NIH/3T3细胞表现出优异的活力，无死细胞。血液相容性结果表明，测试组（含静电纺丝纤维基贴片）显示透明上清液，与PBS组相似，证实了生物传感贴片优异的血液相容性。

为了进一步验证生物传感贴片在糖尿病小鼠模型未感染和感染伤口上的优异生物相容性，对贴附切割生物传感贴片的组织进行了组织学评估。将生物传感贴片放置在伤口表面进行连续监测后，未观察到贴片伤口出现红肿，愈合率与对照组相当。苏木精-伊红（H&E）组织切片图像显示，对照组和实验组均无异物反应。伤口直径和增殖及向上迁移的基底角质形成细胞厚度在对照组和实验组之间无显著差异。免疫荧光染色显示，贴附切割传感贴片的组织中的炎症细胞浸润与对照组一致。

基于设计的贴片令人满意的生物传感特性和生物相容性，将完全集成的FPCB（包括无线通信模块和基于智能手机的用户界面）集成到传感阵列中，以验证其在小鼠中原位检测慢性伤口的能力。

研究显示，在伤口愈合过程中，TNF-α和IL-6在炎症阶段增加，而在增殖和重塑状态中减少。同时，抗炎因子和再生因子（特别是TGF-β1和VEGF）在增殖和重塑状态中逐渐升高。在未感染糖尿病伤口模型中，伤后前两天TNF-α和IL-6水平升高，表明炎症阶段开始。随着TGF-β1和VEGF浓度升高，标志着向增殖和重塑阶段的过渡。此外，与第0天相比，第4天的pH值降低了6%，恒定的温度表明没有感染。

为了进一步验证传感贴片在不同伤口类型中的监测能力，研究人员在感染金黄色葡萄球菌的糖尿病小鼠模型上进行了额外实验。结果显示，感染糖尿病伤口需要超过15天才能完全愈合，明显长于未感染糖尿病伤口模型。重要的是，炎症细胞因子TNF-α和IL-6在整个延长愈合期间保持持续较高的浓度，表现出慢性伤口特征的 prolonged 炎症阶段。相比之下，抗炎因子（TGF-β1）和血管生成因子（VEGF）显示延迟升高，仅在8天后逐渐增加，且浓度保持低于未感染伤口模型中观察到的水平。此外，与第1天相比，第4天的pH值增加了7.5%，感染糖尿病伤口的温度在第4天相比第1天迅速增加，从第4天到第12天保持持续升高，表明持续的细菌负担和全身炎症反应。

研究结论与意义

这项研究报道了一个完全集成的无线生物传感系统，包含多模式生物传感器阵列和电子电路，用于全面原位监测与伤口愈合相关的多个指标。通过将DNA自循环扩增限制在亲水区域并利用四面体DNA结构的固有稳定性，这种柔性、透气且生物相容的生物传感贴片能够灵敏检测低丰度和阶段特异性蛋白质，包括TNF-α、IL-6、TGF-β1和VEGF，在复杂伤口环境中提供稳定监测而不 disrupt 愈合过程。

与常规伤口监测方法相比，该方法实现了卓越的灵敏度和稳定性，同时支持实时多参数检测。除了检测功能，该平台还可以基于分子特征指导治疗决策，并实现与智能敷料的集成以进行响应性治疗输送。

对于成功的临床转化，需要解决几个技术和实践挑战。当前较长的检测时间和一次性传感器设计需要改进反应动力学和再生能力，以增强临床实用性和成本效益。与现有医疗基础设施的无缝集成需要标准化数据格式和直观界面。此外，连续生物标志物监测带来了重要的数据隐私考虑，可以通过强大的加密协议、符合HIPAA的数据管理和患者控制的访问权限来缓解，确保安全临床部署。

总之，这种生物传感策略标志着向实用伤口监测系统的重大进展，该技术的进一步优化和临床验证可能有助于在临床环境中做出更好的治疗决策。