基于母酵母细胞膜表面分子传感器的高灵敏度高通量代谢分析技术及其在定向进化中的应用

本刊推荐：针对现有酵母胞外分泌检测技术灵敏度低、通量有限和速度慢的瓶颈问题，研究人员开发了母酵母细胞膜表面分子传感器(MOMS)技术。该技术通过将适体传感器选择性锚定在母细胞表面，实现了对单细胞分泌物的高灵敏度(检测限100 nM)、高通量(单次筛选>107细胞)和超高速(3.0×103细胞/秒)检测。成功从220万变异体中筛选出香草醛高产菌株，产量提升2.7倍，为大规模代谢分析和生物制造提供了突破性技术平台。

　　

在生命科学和生物制造领域，酵母作为与人类具有高度遗传相似性的模式生物，一直是研究细胞分裂、代谢过程及药物开发的重要工具。然而，现有的酵母胞外分泌检测技术面临重大挑战：传统免疫吸附测定法通量有限，每次实验仅能分析10³-10⁴个细胞；质谱技术虽然能检测多种代谢物，但吞吐量极低（约1个细胞/实验）；荧光激活液滴分选(FADS)技术虽能实现高通量分析，但受限于酶促反应的特异性，只能检测少数代谢物（如α-淀粉酶、乳酸和乙醇），且灵敏度有限（约10 μM）。这些限制严重阻碍了从大规模突变体库（10⁶-10⁷变异体）中快速鉴定稀有高产菌株的能力。

为了突破这些技术瓶颈，研究人员在《Nature Communications》上报道了一种创新性的分子传感器系统——母酵母细胞膜表面分子传感器(MOMS)。该系统利用酵母出芽分裂的不对称性，将适体传感器选择性锚定在母细胞表面而不传递给子细胞，实现了高密度传感器覆盖（1.4×10⁷个传感器/细胞），为单细胞胞外分泌分析提供了全新解决方案。

研究采用微流控液滴封装、流式细胞分选和适体传感器技术，通过对酵母细胞表面进行生物素化修饰，利用链霉亲和素-生物素桥接系统将特异性适体固定在细胞表面。研究使用了来自患者样本的酵母突变体库（2.2×10⁶变异体）进行方法验证。

MOMS制备：研究人员通过三个步骤构建MOMS系统：首先用磺酸基-NHS-LC-生物素对酵母细胞壁蛋白进行生物素化修饰；然后制备适体-链霉亲和素复合物；最后将适体涂层到生物素化酵母细胞上。实验证实MOMS选择性集中在母细胞表面，不影响酵母细胞生理功能或分泌谱，细胞存活率>93%。

母细胞上的选择性密集MOMS涂层：通过Cy5标记的适体涂层和Alexa Fluor 488标记的ConA染色，验证了MOMS在母酵母细胞上的选择性涂层。MOMS涂层仅局限于原始母细胞，随着子细胞出芽形成新膜，确保了高传感器密度。在30多代（3天）后，约77%的MOMS仍保留在母细胞上，保持强烈的Cy5荧光信号。

通过MOMS进行灵敏分子测量：通过在酵母细胞上嫁接密集的MOMS，研究人员开发了一种高灵敏度检测方法，能够通过结构转换适体传感器产生的荧光信号检测目标化合物。MOMS检测限达到100 nM，比当前液滴适体传感器灵敏度提高>100倍。该系统成功实现了对单个酿酒酵母细胞分泌物的可视化观察。

通过组合MOMS进行灵敏多重分析：通过在酵母细胞上涂覆不同的MOMS，每个具有不同的适体序列，研究人员同时检测了多种目标代谢物。实验证明MOMS系统能够同时检测香草醛、ATP和葡萄糖，荧光强度随时间增加而增加，实现了100%的多重检测特异性。

使用MOMS进行高通量筛选：高通量筛选过程包括捕获和筛选两个步骤。利用微流控液滴技术将单个MOMS嫁接的酵母细胞封装在约33-pL的水包油液滴中，经过48小时孵育后，通过流式细胞术进行筛选。该方法吞吐量超过10⁵-10⁶ Hz，比传统液滴筛选提高10-100倍。

使用MOMS进行快速定向演变的高速分析：研究表明，MOMS能够实现分泌菌株的高速分选，用于快速定向演变。在液滴孵育捕获分泌物后，以约3.0×10³细胞/秒的速度通过流式细胞术分析MOMS荧光信号，筛选速度比传统液滴筛选技术快30倍以上。从含有0.5% VAN-3和99.5% WT酵母菌株的混合样品中，成功将分泌群体从0.5%富集到约90%。

MOMS在蛋白质分析中的高灵活性：MOMS是一个高度灵活的平台，通过生物素-链霉亲和素相互作用适应各种传感器类型，能够检测多种分子靶标。除了适体检测外，MOMS系统还可以通过表面涂覆链霉亲和素修饰的抗体适应基于抗体的格式（抗体-MOMS），从而检测更广泛的蛋白质靶标。

研究结论表明，MOMS系统在母酵母细胞表面选择性锚定分子传感器，实现了高密度传感器固定（1.4×10⁷个传感器/细胞），在多达三代细胞分裂过程中保持功能。该系统具有三大优势：高灵敏度（检测限<1μM）、高通量（分析>10⁷个酵母细胞）和高速度（筛选速度比传统液滴分析快30倍以上）。通过从约10⁶个变异体中筛选出前0.05%的母酵母细胞，分泌活性比亲本菌株提高约2.7倍。对排序变体的测序分析发现了四个独特序列，包括原始ech基因中的三个氨基酸替换突变。

该研究的重大意义在于提供了敏感、高通量的筛选和快速分选单细胞酵母分泌的创新分析工具，能够从大量酵母群体中识别目标分泌菌株，为代谢分析和菌株优化开辟了新机遇。该技术不仅适用于代谢物检测，还能扩展到蛋白质分析，包括细胞因子和糖基化蛋白质的检测，在合成生物学、代谢工程和生物制药领域具有广泛应用前景。通过进一步结合内源性香草醛降解途径的破坏和MOMS驱动的定向演变迭代轮次，这些菌株有望实现工业相关效价（如>2.5g/L）的大规模香草醛生产。