创伤性脑损伤后外周来源巨噬细胞的命运图谱揭示其长期存留特性及独特的疾病相关转录特征

本研究针对创伤性脑损伤（TBI）后外周单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）的长期动态变化这一关键科学问题，通过利用Ccr2-creERT2和Ms4a3-cre两种互补的命运追踪小鼠模型，结合多组学分析和行为学检测，首次发现MDMs在脑内可存留至少8个月并保持吞噬活性，其转录特征与衰老和神经退行性疾病相关，且在人类TBI和阿尔茨海默病样本中高度富集，为靶向髓系细胞的治疗策略提供了重要理论基础。

　　

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致长期身体、认知和情感障碍的主要因素，构成重大公共卫生挑战。TBI诱导的神经炎症涉及脑内定居的小胶质细胞（microglia）和外周来源的单核细胞衍生巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs）。尽管先前研究表明MDMs会导致长期记忆缺陷，但这些细胞在渗入大脑后的长期行为模式仍不明确。特别值得注意的是，关于浸润单核细胞是否能够转化为定居小胶质细胞存在争议：部分研究认为脑内入侵的单核细胞不会贡献于小胶质细胞池，而其他团队则描述浸润单核细胞可向小胶质细胞转化。这些研究的关键局限性在于缺乏可靠的细胞追踪工具，导致对浸润单核细胞和巨噬细胞的真实起源和身份认知模糊。

为解决这一科学问题，研究团队在《Nature Communications》上发表了突破性研究成果，利用两种互补的命运映射小鼠品系——CCR2-creERT2和Ms4a3-cre——实现了对MDMs的精确持久体内追踪。这些模型基于单核细胞特异性表达的Ccr2和Ms4a3启动子，能够特异性标记单系骨髓祖细胞，已被用于研究大脑发育、中风、辐射和神经炎症中的巨噬细胞长期轨迹。

研究人员采用的主要技术方法包括：①利用Ccr2-creERT2::Ai14D和Ms4a3-cre::Ai14D双转基因小鼠模型进行细胞命运追踪；②通过流式细胞术分析细胞群动态变化；③采用免疫荧光和三维成像技术进行空间定位分析；④使用体内吞噬功能测定评估细胞功能；⑤进行批量RNA测序和单核RNA测序（snRNA-seq）分析转录组特征；⑥应用径向臂水迷宫（RAWM）行为学测试评估认知功能；⑦整合分析人类脑组织样本（来自太平洋西北脑捐献网络的创伤性脑损伤患者和西雅图阿尔茨海默病脑细胞图谱的样本）。

MDMs在脑内持续存在至少8个月

通过Ccr2-creERT2系统的时间控制标记，研究人员发现急性期浸润的MDMs在TBI后7天、30天和8个月时仍存在于大脑中。流式细胞分析显示，tdTomato⁺ MDMs在TBI后7天约占CD11b⁺CD45⁺脑细胞群的8.2%，30天后为1.52%，8个月后仍保持0.71%。重要的是，在假手术组小鼠或TBI小鼠的对侧半球未检测到标记细胞。

TBI诱导的认知缺陷持续至少8个月

通过径向臂水迷宫（RAWM）测试，研究发现TBI小鼠在损伤后7天、30天和8个月均表现出显著的学习记忆障碍。双因素重复测量方差分析显示TBI效应在7天（F_1,30=9.783, p=0.0039）、30天（F_1,28=9.803, p=0.0041）和8个月（F_1,32=5.792, p=0.0220）均显著，表明认知缺陷长期存在。

MDMs聚集在损伤周边区域并经历表型转变

空间定位分析显示，tdTomato⁺ MDMs在TBI后7天主要集中在空化区域，少量分布在第三脑室、脉络丛和海马CA1/DG区域。在慢性时间点，细胞主要位于同侧海马下方的丘脑和脉络丛中。随时间推移，表达离子钙结合适配分子1（Iba1，泛髓系细胞标志物）的tdTomato⁺细胞比例显著增加（单因素ANOVA，F_2,11=51.17, p<0.0001），但仅约10%的MDMs表达小胶质细胞特异性标志物P2ry12。

MDMs在植入TBI大脑后保持吞噬能力

通过体内吞噬功能测定，研究发现tdTomato⁺ MDMs在TBI后7天和30天均保持吞噬合成荧光珠的能力，且两者之间无显著差异，证明MDMs在急性和慢性期均保持功能活性。

MDMs保持独特的转录特征

批量RNA测序分析显示，MDMs的转录组随时间动态变化。稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）发现，第1判别成分捕获了MDMs脑内植入后的时间动态，第2成分突出了MDMs与8个月时小胶质细胞的明显分离，第3成分分离了7天和30天的MDMs。

在TBI后8个月，MDMs相对于小胶质细胞上调了免疫系统激活（如补体级联、白细胞介素-2信号传导、白三烯和Eoxins合成）、细胞间相互作用（如CDH11表达和功能调节、同型细胞-细胞粘附调节、RAS信号传导）和信号转导（如通过NRAGE、NRIF和NADE的细胞死亡信号传导）相关术语。

差异基因表达分析显示，MDMs高表达Ccl2、Ccr2、Lyz2和F4/80（Adgre1），低表达小胶质细胞标志基因如Sall1、Hexb、Tmem119和P2ry12。与疾病炎症巨噬细胞（DIM）、疾病相关小胶质细胞（DAM）、SenMayo衰老特征、小胶质细胞衰老和加速小胶质细胞衰老特征相比，MDMs显著富集这些疾病和衰老相关特征。

MDMs共享跨模型的核心转录组特征

研究人员通过Ms4a3-cre模型验证了上述发现，并确定了114个在不同小鼠模型和脑扰动中共同上调的MDMs核心基因。这些基因富集于抗原加工提呈、免疫细胞激活和分化等免疫反应通路。重要的是，该核心特征在人类TBI患者的脑髓系细胞和阿尔茨海默病患者的脑样本中均显著富集。

研究结论表明，使用两种独立互补的命运映射系统，研究团队描述了TBI后在小鼠脑实质中持续存在至少8个月的MDMs群体。这些细胞随时间发生形态变化并获得泛髓系细胞标志物Iba1，但不会完全分化为小胶质细胞。研究人员鉴定出了跨小鼠模型和脑扰动共享的MDMs核心转录组特征，该特征在男性TBI受试者和阿尔茨海默病患者的脑髓系细胞中同样富集。

这些发现增强了我们对TBI后MDMs动态变化的理解，为未来开发靶向髓系细胞的治疗策略提供了重要信息。研究的局限性包括命运映射模型的固有约束：Ccr2-CreERT2系统需要他莫昔芬诱导激活，可能导致对TBI后浸润的MDMs全群体的低估；而Ms4a3-Cre组成型模型标记所有MDMs，但缺乏时间特异性。此外，体内吞噬功能测定仅在TBI后7天和30天进行，未直接评估8个月时间点的MDMs功能状态。

尽管如此，这项研究首次揭示了TBI后外周来源巨噬细胞的长期存留特性及其独特的疾病相关转录特征，为理解神经炎症的长期机制和开发针对神经退行性疾病的治疗策略提供了重要见解。