综述：MASH中的无菌性炎症：细胞外RNA的新兴作用及治疗策略

本综述系统阐述了代谢相关脂肪性肝病（MASLD）及其进展形式MASH中无菌性炎症的核心机制，重点揭示了细胞外RNA（eRNA）作为新型损伤相关分子模式（DAMP）通过激活Toll样受体（TLR）3等模式识别受体（PRR）驱动炎症级联反应的关键作用，并前瞻性探讨了基于核糖核酸酶（RNase）1的治疗策略（如RSLV-132）在降解eRNA、阻断TLR3/cGAS-STING/NLRP3炎症小体信号通路中的应用潜力，为靶向免疫代谢交叉对话提供了新视角。

　　

Sterile inflammation in MASH: emerging role of extracellular RNA and therapeutic strategies

Triggers of sterile inflammation in MASLD

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）及其进展形式代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是全球主要的健康问题，其病理过程涉及代谢失调、肝脏脂毒性和慢性炎症。无菌性炎症作为MASH发病机制的关键驱动因素，是一种由受损或死亡肝细胞释放的内源性危险信号分子触发的非感染性免疫反应。这些被称为损伤相关分子模式（DAMP）的分子，通过激活天然免疫受体（如Toll样受体（TLR）、NOD样受体以及环GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路），促使炎症信号传导、细胞因子产生、免疫细胞募集，并最终导致MASH中的纤维化活化。

脂毒性是MASLD中无菌性炎症的核心驱动因素。全身性胰岛素抵抗和肝脏脂质代谢紊乱导致有毒脂质物种（如饱和游离脂肪酸（FFAs）、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱和甘油二酯）过度积累，从而引发脂毒性。脂毒性通过激活应激激酶、诱导线粒体功能障碍和内质网（ER）应激来扰乱细胞稳态，最终导致细胞通过凋亡、坏死性凋亡或细胞焦亡等方式死亡。棕榈酸酯增强了线粒体活性氧（ROS）的产生和ER应激，促进了促凋亡通路（如CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）和Jun-N-末端激酶（JNK））的激活。脂毒性细胞死亡不仅损害肝细胞活力，还导致免疫原性DAMP（包括高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、线粒体DNA（mtDNA）和细胞外RNA（eRNA））的释放，这些DAMP与天然免疫细胞上的PRR结合，放大了肝脏炎症。

Release of danger-associated molecular patterns(DAMPs)

在MASLD肝脏中，多种DAMP的释放驱动了无菌性炎症。其中包括：

1. 1.
   HMGB1：作为一种核内非组蛋白，在细胞应激、损伤或坏死时释放到细胞外空间，成为一种有效的DAMP。它与TLR2、TLR4和TLR9等受体相互作用，激活核因子κB（NF-κB），导致肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6和IL-1β等促炎细胞因子的产生。
2. 2.
   ATP：在肝细胞损伤期间，从肝细胞释放的ATP被免疫细胞识别为DAMP。细胞外ATP激活库普弗细胞和其他天然免疫细胞上的嘌呤能受体P2X7，导致钾外流和NACHT、LRR和PYD结构域包含蛋白3（NLRP3）炎症小体的组装，进而分泌成熟形式的IL-1β和IL-18。
3. 3.
   线粒体DNA（mtDNA）：线粒体功能障碍导致mtDNA释放到细胞外。mtDNA类似于细菌DNA，可激活内体TLR9和胞质cGAS-STING通路，从而诱导NF-κB介导的细胞因子和I型干扰素产生，放大肝脏炎症。

Novel mediators of sterile inflammation in MASH Extracellular RNA(eRNA) as a Novel DAMP

细胞外RNA（eRNA）作为新型DAMP，近年来被认识到在MASH的无菌性炎症中扮演关键角色。eRNA包含多种异质性RNA物种，如信使RNA（mRNA）、微RNA（miRNA）、转移RNA（tRNA）和长链非编码RNA（lncRNA），它们存在于血浆、血清和尿液中。这些RNA可与脂蛋白、核糖核蛋白或细胞外囊泡（EVs）（如外泌体）结合，或以游离形式存在。在由脂毒性、铁过载、线粒体功能障碍、ER应激和氧化应激引起的肝细胞损伤或死亡条件下，细胞完整性受损，细胞内RNA可能通过EVs（外泌体或微囊泡）、凋亡小体或无细胞eRNA物种被动释放或主动分泌到细胞外环境中。

Types of eRNA and their distinct roles in MASH pathogenesis

eRNA的不同亚型在MASH发病机制中具有 distinct 作用：

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  信使RNA（mRNA）：从受损肝细胞释放的细胞外mRNA作为DAMP，在MASH环境中放大炎症并促进肝细胞死亡。当通过EVs递送到邻近细胞时，这些mRNA可能有助于遗传信息的水平转移，并调节肝细胞和非实质肝细胞中的基因表达模式。
• •
  微RNA（miRNAs）：与外泌体相关和蛋白质结合的miRNA是细胞间信号传导的核心调节因子。外泌体miR-122、miR-192和miR-34a已知参与驱动肝细胞损伤、肝星状细胞（HSC）活化和免疫细胞极化。miR-122促进肝细胞中的促炎信号传导，而miR-192通过诱导M1巨噬细胞极化增强肝脏炎症。抑制miR-34a可通过过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和去乙酰化酶Sirt1减少肝脂肪变性。
• •
  转移RNA（tRNA）：在氧化或代谢应激下产生的tRNA衍生小RNA（tsRNA）可作为信号分子。赖氨酸tRNA片段和miR-194-5p被证明在饮食诱导的肥胖小鼠中通过β-Klotho和脂滴包被蛋白perilipin 2共同调节肝脂肪变性。
• •
  长链非编码RNA（lncRNAs）：如EVs中发现的TUC339和H19，与促进炎症信号传导和HSC活化有关。TUC339调节巨噬细胞极化和炎症信号传导，而FincoR等肝脏富集的lncRNA可能在MASH期间被激活并调节炎症和纤维化通路。

Known triggers and mechanisms of eRNA release

eRNA的释放与细胞应激和肝损伤密切相关。已知的触发因素包括：

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  脂毒性：游离脂肪酸（FFAs）的过度积累诱导肝细胞应激和脂性凋亡，导致eRNA通过膜通透性改变或EVs（如外泌体和微囊泡）释放。
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  氧化应激和线粒体功能障碍：ROS和受损的线粒体代谢促进细胞损伤和eRNA的非经典分泌。过量的ROS不仅损害肝细胞，还触发或放大细胞应激反应。
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  铁过载：铁诱导的肝细胞毒性也促使eRNA的早期释放，这些eRNA随后作为危险信号作用于邻近细胞。
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  细胞死亡通路：与凋亡、坏死、细胞焦亡和铁死亡相关的细胞死亡通路可通过破坏质膜完整性促进eRNA释放。该过程通常涉及将eRNA包装到EVs中，这是一个受ER应激、死亡受体通路（如死亡受体5（DR5）和Rho关联卷曲螺旋含蛋白激酶1（ROCK1））激活以及可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白参与以进行囊泡运输和与质膜融合的调节过程。

Extracellular RNA in MASLD/MASH

肝细胞是MASLD/MASH中eRNA的主要来源，它们要么在损伤时被动释放，要么通过外泌体和微囊泡主动分泌。非实质肝细胞（包括胆管细胞、HSC、肝窦内皮细胞和激活的免疫细胞（如中性粒细胞））也贡献于eRNA微环境。脂肪组织和发炎的肠道上皮也分泌eRNA，这些eRNA可能通过门脉循环到达肝脏，放大局部炎症。

eRNA在MASLD/MASH中的致病作用包括：在肝细胞损伤后释放到细胞外空间，作为应激信号与肝细胞和免疫细胞上的PRR（如TLR）结合。这种受体结合触发NF-κB激活，导致大量促炎细胞因子（如TNFα和IL-6）和趋化因子的产生，导致免疫细胞募集、炎症放大和进一步的肝细胞损伤。eRNA还通过多种机制使肝脏病理持续存在，例如促使肝细胞激活与细胞死亡和应激相关的基因，刺激转化生长因子β（TGF-β1）等信号分子的释放以激活HSC，以及包装在EVs内的eRNA被其他肝细胞摄取，改变其基因表达并使其更容易受到进一步损伤。

近期研究还强调了eRNA在HSC活化和纤维化中的关键作用。从应激或受损肝细胞释放的eRNA（尤其是miRNA和环状RNA（circRNA））通过EVs转移至HSC。这些eRNA货物的摄取激活了细胞内信号通路，特别是NF-κB和TGF-β/Smad通路，从而调节关键纤维化基因（包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原、TGF-β1和细胞通讯网络因子2（CCN2））的表达。这种细胞间RNA介导的通讯驱动HSC转分化，支持细胞外基质（ECM）积累和疾病进展。

Immune players in sterile inflammation

MASH中的免疫介导的肝细胞损伤是一个由先天性和适应性免疫细胞、肝细胞和HSC之间相互作用 orchestrate 的复杂过程。

Innate immune players

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  库普弗细胞和巨噬细胞：作为应对无菌炎症的第一道防线，通过PRR识别DAMP后激活下游炎症级联反应。它们极化为M1（经典激活）和M2（替代激活）表型。M1巨噬细胞释放高水平的促炎介质，通过放大DAMP加重肝细胞损伤。M2巨噬细胞则促进愈合、组织修复和基质重塑，但其促纤维化活性在疾病后期可能通过过度纤维化产生不利影响。肝脏相关巨噬细胞（LAMs）等特殊巨噬细胞亚群在组织重塑中发挥作用。
• •
  中性粒细胞：通过释放ROS和蛋白酶（如弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（MPO））等有毒物质，以及形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来贡献于肝损伤。NETs由DNA、组蛋白和抗菌蛋白组成，可与邻近免疫细胞相互作用，激活cGAS-STING和NLRP3炎症小体通路，触发促炎细胞因子的释放。NETs还能刺激HSC中的TLR9信号传导，从而促进HSC活化和纤维化。
• •
  树突状细胞：通过感知DAMP（如HMGB1）来调节对肝损伤的免疫反应。DAMP与树突状细胞上的PRR结合后诱导其成熟和激活，增强其对T细胞的抗原呈递并引发促炎细胞因子的分泌。在肝损伤时，树突状细胞向促炎表型转变，从而放大局部炎症。
• •
  自然杀伤（NK）细胞：在MASLD及其向MASH的进展中扮演复杂且阶段依赖性的角色。在早期，NK细胞可能对脂质 overload 的肝细胞表现出细胞毒性活性。它们也可能通过杀死激活的HSC发挥抗纤维化作用，但在持续炎症条件下，它们可通过维持促炎环境来传播纤维化信号。先天淋巴样细胞（ILC）亚群也调节肝脏炎症微环境并促进纤维生成。

Adaptive immune players

适应性免疫细胞是放大和塑造肝脏无菌炎症景观的积极参与者。

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  CD4⁺ T细胞：特别是Th1和Th17亚群，在MASH肝脏中积累并分泌干扰素γ（IFN-γ）和IL-17A，维持慢性炎症并促进星状细胞活化。
• •
  CD8⁺ T细胞：通过释放细胞毒性效应分子（如穿孔素、颗粒酶B和Fas配体）直接导致肝细胞死亡。
• •
  B细胞：通过抗原依赖和非依赖机制贡献于MASH。促炎性B2细胞响应DAMP而激活，产生IL-6和TNF-α，促进进一步的免疫细胞募集和肝细胞损伤。B细胞耗竭的小鼠模型显示肝脏炎症和纤维化减少。

Key signaling pathways driving sterile inflammation in MASLD

介导MASLD中无菌炎症的关键免疫信号通路包括：

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  Toll样受体（TLR）信号：TLR家族（如TLR2、TLR4、TLR9）是代谢应激与肝脏炎症信号之间的分子界面。它们响应内源性配体（如LPS、饱和FFAs、HMGB1），通过髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）和TIR结构域包含适配器诱导干扰素β（TRIF）激活NF-κB，导致促炎细胞因子和趋化因子产生。eRNA被鉴定为天然免疫激活的有效内源性触发因子，被肝免疫细胞中的TLR3、TLR7和TLR8识别。TLR3激活TRIF依赖通路，促进IRF3/7和NF-κB介导的I型干扰素和炎症细胞因子产生。
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  NLRP3炎症小体激活：NOD样受体（NLR）是感知PAMP和DAMP的专门胞内PRR。NLRP3响应DAMP，与ASC形成复合物激活caspase-1，进而切割IL-1β和IL-18的前体成为成熟形式，这些细胞因子促进肝脏炎症和纤维化。
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  cGAS-STING通路：是胞质DNA传感的关键传感器，在线粒体功能障碍相关的MASLD中，该轴将线粒体应激与慢性肝脏炎症和进行性纤维化联系起来。胞质mtDNA被cGAS感知，产生第二信使cGAMP以激活内质网上的STING，进而触发TBK1和IKK的招募和磷酸化，导致IRF3和NF-κB激活，产生I型干扰素和促炎细胞因子。
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  JNK（c-Jun N-末端激酶）通路：一种应激激活激酶，在响应脂毒性、氧化应激、ER应激和促炎细胞因子时被激活。JNK1的激活导致转录因子（如c-Jun）的磷酸化，诱导促炎细胞因子的产生，并增强肝细胞对TNF-α介导凋亡的敏感性。
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  ER应激和未折叠蛋白反应（UPR）：ER功能紊乱导致未折叠或错误折叠蛋白积累，通过三个关键传感器（PERK、ATF6、IRE1）激活UPR，促进炎症信号传导。PERK激活NF-κB信号，IRE1触发JNK和IKK，ATF6也参与NF-κB激活。慢性ER应激导致促炎因子（包括EVs和DAMP）的释放。

Therapeutic targeting of eRNA in MASH

由受损细胞释放的eRNA在各种疾病中充当免疫信号传导和组织损伤之间串扰的催化剂，作为加剧炎症和恶化疾病发病机制的因子。这些eRNA通过激活PRR（如TLR3、TLR7和RIG-I样受体）并促进抗病毒样炎症级联（如NF-κB通路和I型干扰素反应）来触发天然免疫反应。

RNA-specific approaches and RNase-based therapies

多种小鼠模型表明，施用RNase1（一种重组核糖核酸酶）可显著降低循环和肝脏中的eRNA，从而减轻肝脏炎症。TLR3（感知细胞外RNA的关键受体）的药理学阻断也被证明在临床前MASH模型中可改善脂肪性肝炎并减少肝损伤。最近的研究证明了肝脏脂毒性驱动的eRNA释放，其作为免疫刺激剂激活下游TLR3/TLR7信号传导，促进促炎细胞因子和趋化因子的产生，使炎症和组织损伤循环持续存在。通过RNase1抑制eRNA的生物活性或抑制TLR3信号传导，显著降低了棕榈酸酯诱导的肝细胞应激和炎症，并减轻了小鼠由MASH诱导饮食引起的肝损伤。RNase1治疗显著提高了暴露于棕榈酸酯诱导脂毒性的HepG2细胞的细胞活力，减少了凋亡，并降低了应激相关激酶（如JNK和p38MAPK）的激活。此外，RNase1给药抑制了NF-κB激活以及这些细胞中后续促炎细胞因子（包括IL-6和TNF-α）的产生。这些发现在体内实验中得到进一步证实，RNase1治疗减少了肝脂肪变性，降低了血清ALT水平，并减轻了肝脏炎症和纤维化。

由于其降解eRNA的能力，RNase1已成为治疗脓毒症和全身炎症反应综合征（SIRS）以及几种癌症（包括非小细胞肺癌（NSCLC））的有前途的治疗候选药物。基于核糖核酸酶的治疗药物Ranpirnase（onconase）已在肾癌和恶性间皮瘤中进行测试。凭借令人鼓舞的临床前证据以及在其他炎症和纤维化疾病中不断增长的记录，RNase1作为MASH的一种新型疗法具有相当大的前景，能够减少脂肪变性、炎症和纤维化。RNase1通过中断肝细胞应激、细胞因子释放和免疫细胞募集的自我 perpetuating 循环，代表了MASH中eRNA介导的免疫激活的一个有希望的治疗靶点，从而防止MASH中的纤维化活化。

Clinical trials

RSLV-132是一种基于RNase1的非免疫抑制生物制剂，已在自身免疫性疾病中进行了一项2期、多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验评估。RSLV-132是一种催化活性RNase，与人IgG1的Fc区融合。它被设计用于延长循环时间，并旨在降解血液中存在的eRNA，特别是自由循环或与自身抗体和免疫复合物复合的RNA。因此，RSLV-132阻止eRNA与PRR（特别是TLR3）结合。RSLV-132的独特结构确保其保留在细胞外并且不渗透细胞膜以降解细胞内RNA，从而选择性靶向致病性eRNA。

通过消化循环eRNA，RSLV-132破坏了慢性炎症信号传导的关键刺激物。由eRNA信号传导助长的慢性炎症有助于脂质代谢受损、肝细胞损伤和肝脂肪变性的恶化。RSLV-132可能通过减轻分子水平的炎症来帮助恢复正常的脂质代谢。炎症与HSC活化和纤维化基质沉积紧密相关。通过减弱上游eRNA驱动的炎症循环，RSLV-132间接限制了星状细胞的旁分泌激活（通过减少TGF-β和其他促纤维化细胞因子），从而抑制纤维生成。在其他炎症条件下的临床前数据支持，血浆中持续的RNase活性可以减轻炎症和纤维化进展。

Conclusion and future directions

由DAMP（如HMGB1、ATP、mtDNA和eRNA）驱动的无菌性炎症，通过激活天然免疫信号通路（如TLR、NLRP3炎症小体和cGAS-STING通路），在从单纯性肝脂肪变性向MASH的转变中起着关键作用。近年来，eRNA通过天然免疫传感器（如TLR3）发挥作用，被确定为连接代谢失调与免疫激活的肝脏炎症的关键放大器。阐明eRNA、其他DAMP和下游炎症通路之间的串扰，为开发更精确的MASH管理策略带来了希望。

在此背景下，鉴定基于RNase1的疗法（可以降解eRNA）可能是治疗MASH炎症和肝损伤的一种有前途的方法。然而，基于RNase1和/或TLR3拮抗作用的疗法的特异性、安全性和有效性需要在相关的动物模型中进行严格测试，并最终在人体临床试验中进行测试。

尽管已经研究了eRNA亚集（如microRNA、tRNA片段和lncRNA），但许多eRNA类别的具体作用及其在肝脏微环境中的细胞类型起源尚未完全确定。此外，控制eRNA选择性包装到EVs中并促进其靶向递送至HSC、免疫细胞和其他实质细胞的分子机制也知之甚少。大多数机制见解来源于体外和动物模型，有限的人类研究验证了eRNA特征作为可靠的生物标志物或治疗靶点。需要整合eRNA分析和疾病表型分析的大规模临床队列来弥合这一差距。

虽然本综述强调了靶向无菌炎症的有前途的治疗途径（如抑制DAMP释放、受体拮抗、免疫细胞调节、基于RNA的方法、转化研究和临床试验），但这些仍然有限。未来的研究应侧重于全面分析不同疾病阶段和患者亚组中DAMP（包括eRNA物种）的特征。需要进一步的研究来了解eRNA和其他DAMP在炎症和纤维化中的信号网络和细胞特异性作用。最后，必须全面评估新兴治疗策略（包括RNase1给药和TLR3拮抗作用）的安全性、特异性和有效性，以转化有前途的临床前结果。