酮类挥发性有机化合物通过多途径机制抑制 Pseudogymnoascus destructans 的转录组学研究

本研究系统探讨了2-十一酮和2-壬酮两种酮类挥发性有机化合物（VOCs）对白鼻综合征致病真菌Pseudogymnoascus destructans（Pd）的多层次抑制机制。通过转录组学（RNA-seq）分析发现，这两种化合物能破坏细胞壁/膜完整性、干扰核糖体生物合成（涉及rRNA 2’-O-甲基化和假尿苷化修饰）、抑制三羧酸循环（TCA cycle）关键酶活性，并激活DNA损伤修复通路。研究为开发针对Pd的新型熏蒸剂提供了理论依据，对保护蝙蝠种群和维护生态系统健康具有重要意义。

　　

抗Pd活性评估

研究通过体外抑菌实验评估了2-十一酮和2-壬酮对Pd的抑制效果。结果显示，2-十一酮的最小抑制浓度（MIC）为25.94 μg/mL，半抑制浓度（IC₅₀）为6.49 μg/mL；2-壬酮的MIC为135.41 μg/mL，IC₅₀为38.69 μg/mL。2-十一酮表现出更强的抑制活性，在低至0.13 mg/mL浓度下即可完全抑制Pd生长。

形态结构影响

扫描电镜观察发现，经IC₅₀浓度酮类化合物处理后，Pd菌丝形态发生显著改变。对照组菌丝挺直、表面光滑、分隔规则；2-十一酮处理组出现菌丝断裂、塌陷收缩和表面破裂；2-壬酮处理组则表现为菌丝显著弯曲和收缩。这表明酮类化合物能直接破坏Pd的细胞结构完整性。

转录组响应特征

RNA测序共获得6.27亿条高质量 reads，映射率达到90.82%-94.3%。主成分分析（PCA）显示处理组与对照组基因表达谱存在显著分离（2-十一酮组R²=0.700，2-壬酮组R²=0.444）。差异表达基因（DEGs）分析发现，2-十一酮处理组有1，603个DEGs（915个上调，688个下调），2-壬酮组有1，349个DEGs（714个上调，635个下调）。

细胞壁与膜相关基因表达

酮类处理显著影响细胞壁合成相关基因表达。α-1，3-葡聚糖合成酶基因（AGS1_2， AGS1_3， AGS1_4， AGS1_5）和几丁质合成相关基因VC83_02184均显著上调，表明Pd试图通过增强细胞壁合成来应对酮类胁迫。在膜结构方面，2-十一酮显著下调麦角固醇合成关键基因ERG11（3.71倍）和ERG6（3.20倍），2-壬酮下调ERG28表达（2.44倍）。同时，不饱和脂肪酸合成相关基因普遍下调，而脂肪酸合成基因上调，提示膜流动性和完整性发生改变。

遗传信息处理与应激响应

核糖体生物合成是受影响最显著的途径之一。2-十一酮处理组有36个核糖体生物合成相关DEGs下调，2-壬酮组有26个。rRNA前体的2’-O-甲基化和假尿苷化修饰过程受到显著抑制。核糖体组装关键基因如Nop1（催化甲基转移酶活性）、SNU13（参与U3 snoRNP复合体组装）、NOP56和NOP58等表达均下调。特别值得注意的是，mRNA周转和核糖体组装蛋白基因MRT4在2-壬酮和2-十一酮处理组分别下调4.67倍和13.31倍。

2-壬酮处理还显著激活了DNA损伤修复机制，包括错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复和同源重组修复通路。DNA修复蛋白RAD52、复制蛋白A、DNA连接酶和DNA聚合酶等相关基因均显著上调。这表明2-壬酮可能直接损伤Pd的DNA分子。

孢子发育与线粒体功能

孢子发育调控基因RYP2（来自Ajellomyces capsulatus的同源基因）在2-壬酮和2-十一酮处理组分别下调3.26倍和3.40倍。分生孢子发育调控基因abaA（来自Penicillium rubens的同源基因）VC83_07479在2-壬酮处理组下调5.55倍。在线粒体功能方面，2-十一酮显著下调TCA循环关键酶基因（乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶），而2-壬酮处理组ATP水解通路基因显著上调。

毒力相关基因表达

研究检测了50个与Pd毒力相关的基因，发现26个基因表达发生显著变化。细胞外蛋白降解相关的三肽基肽酶sed2基因显著下调，主要过敏原Aspf2同源基因VC83_01361表达水平也降低。一些热休克反应相关基因表达上调，表明Pd试图通过分子伴侣协助蛋白质正确折叠来应对酮类胁迫。

qRT-PCR验证

随机选择8个DEGs进行qRT-PCR验证，结果与RNA-seq数据一致。细胞壁相关基因VC83_07327、热休克反应基因VC83_00970和DNA修复基因VC83_01131上调；核糖体相关基因VC83_08709、能量代谢基因VC83_04645和VC83_03131、氧化应激基因VC83_01344和毒力相关基因VC83_01361下调。

讨论

研究表明酮类VOCs通过多途径机制抑制Pd生长。细胞壁和膜结构破坏是首要作用位点，α-1，3-葡聚糖合成酶基因上调是Pd的应激响应。麦角固醇合成抑制与唑类抗真菌药物作用机制相似。核糖体生物合成抑制特别是rRNA修饰干扰，直接影响蛋白质合成能力。2-十一酮通过抑制TCA循环关键酶干扰能量代谢，2-壬酮则直接引起DNA损伤并激活修复机制。

研究还发现酮类化合物影响Pd的孢子发育和毒力因子表达，这可能减少其传播能力和致病性。热休克蛋白基因上调表明Pd试图通过分子伴侣保护来应对蛋白质变性压力。

应用前景与局限

酮类化合物作为潜在抗Pd制剂具有低脊椎动物毒性和昆虫驱避特性，适合用于蝙蝠洞穴环境。但当前研究在实验室培养基（SDA）中进行，与实际蝙蝠皮肤或洞穴环境存在差异。未来需在感染模型和野外模拟中评估酮类化合物的有效性、安全性以及对宿主-病原体互作的影响。环境因素如洞穴温湿度对VOCs扩散和维持有效浓度的影响也需要充分考虑。