酮类挥发性有机化合物对抗Pseudogymnoascus destructans的抗真菌机制

《Virulence》：Antifungal mechanism of ketone volatile organic compounds against Pseudogymnoascus destructans

酮类化合物通过破坏细胞壁膜结构、干扰核糖体组装及能量代谢抑制白鼻病真菌（Pseudogymnoascus destructans）的孢子萌发与菌丝生长，其中2-undecanone的最低抑菌浓度为25.94 μg/mL，2-nonanone为135.41 μg/mL，二者均激活DNA损伤修复机制。

　　在自然界中，微生物通过代谢活动产生多种挥发性有机化合物（VOCs），这些化合物具有广泛的生物活性，包括抗微生物、促生长、调控宿主免疫反应等。其中，酮类化合物因其对多种病原真菌表现出显著的抑制作用而受到关注。近年来，随着对真菌性疾病的深入研究，特别是对白鼻症（White-Nose Syndrome, WNS）这一由致病性真菌 *Pseudogymnoascus destructans*（简称 *Pd*）引发的疾病，VOCs 在病原体控制中的应用潜力逐渐显现。白鼻症对蝙蝠种群造成了严重威胁，尤其是在北美地区，导致了多个蝙蝠物种的区域性灭绝。然而，与北美不同，欧洲和亚洲的蝙蝠种群似乎对 *Pd* 的感染表现出较低的死亡率，这提示可能存在某种宿主抗性机制，值得进一步探索。在本研究中，我们通过转录组分析，探讨了两种酮类化合物——2-十一烷酮和2-壬烷酮对 *Pd* 的影响，以揭示其抗真菌作用的潜在机制。

### 研究背景与意义

真菌性疾病对生态系统的稳定性构成重大挑战，尤其是在农业和野生动物保护领域。VOCs 作为一类具有挥发性和生物活性的分子，因其对真菌的抑制作用而被广泛研究。例如，一些研究发现，由 *Pseudomonas* 细菌产生的 2-壬烷酮和 2-庚烷酮对多种病原真菌具有显著的抑制效果，包括 *Agrobacterium tumefaciens* 和 *Colletotrichum acutatum*。此外， *Bacillus velezensis* 产生的 2-十一烷酮能够完全抑制 *Fusarium graminearum* 的生长。这些研究提示，酮类化合物可能在抗真菌策略中发挥重要作用。

然而，尽管已有大量关于酮类化合物抗真菌活性的研究，其具体作用机制仍不明确。特别是在 *Pd* 与这些化合物的相互作用方面，相关研究较少。 *Pd* 是白鼻症的主要病原体，其感染导致蝙蝠种群的大量死亡，因此深入理解其对 *Pd* 的作用机制，对于开发新的抗真菌策略具有重要意义。本研究旨在通过转录组分析，揭示这两种酮类化合物如何影响 *Pd* 的基因表达模式，进而探索其抑制作用的潜在生物学途径。

### 研究方法

在本研究中，我们首先获取了 *Pd* 的菌株，并通过实验确定了其对 2-壬烷酮和 2-十一烷酮的最小抑制浓度（MIC）和半数抑制浓度（IC50）。通过将菌株接种在特定培养基上，并使用不同浓度的酮类化合物进行处理，我们观察到这些化合物对 *Pd* 的生长抑制效果。随后，我们利用扫描电子显微镜（SEM）观察了处理后 *Pd* 的形态变化，发现这些化合物显著改变了菌丝的结构，包括断裂、皱缩和表面破损等现象。

为了进一步解析酮类化合物对 *Pd* 的影响，我们进行了RNA测序（RNA-seq）分析。通过对12个 *Pd* 样本进行转录组测序，我们获得了超过6亿条高质量的RNA序列数据。经过质量控制和比对分析，我们发现这些酮类化合物对 *Pd* 的基因表达模式产生了显著影响，包括多个基因的上调和下调。为了验证这些基因的表达变化，我们还采用了定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术，对部分差异表达基因（DEGs）进行了验证，结果与RNA-seq数据一致，表明转录组分析的准确性。

### 研究结果

通过RNA-seq和qRT-PCR的综合分析，我们发现这两种酮类化合物对 *Pd* 的多个生物学过程产生了影响。首先，在细胞壁和细胞膜方面，这两种化合物显著改变了与这些结构相关的基因表达。例如，2-壬烷酮和2-十一烷酮均上调了编码α-1,3-葡聚糖合成酶的基因，包括 *AGS1_2*、*AGS1_3*、*AGS1_4* 和 *AGS1_5*，以及参与几丁质合成的 *VC83_02184* 基因。这些变化可能表明 *Pd* 在面对酮类化合物时，启动了某种应激反应，以调整其细胞壁成分，从而应对外界压力。

此外，这两种酮类化合物还影响了 *Pd* 的细胞膜稳定性。例如，2-十一烷酮显著下调了 *ERG11* 和 *ERG6* 基因的表达，这两个基因与细胞膜中的麦角甾醇合成有关，而麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分。这种下调可能意味着酮类化合物通过干扰细胞膜成分的合成，从而破坏其结构完整性。在2-壬烷酮处理组中， *ERG28* 基因的表达也显著降低，进一步支持了这一观点。

在能量代谢方面，2-十一烷酮显著影响了 *Pd* 的三羧酸循环（TCA cycle）相关基因的表达。例如，编码乙酰辅酶A脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的基因在2-十一烷酮处理后表现出明显的下调趋势。这可能表明，该化合物通过干扰TCA循环的关键酶活性，影响了 *Pd* 的能量代谢过程，从而抑制其生长。相比之下，2-壬烷酮则上调了ATP水解相关基因的表达，可能通过增强ATP的分解来干扰 *Pd* 的能量供应。

在遗传信息处理方面，这两种酮类化合物均影响了 *Pd* 的核糖体生物合成和RNA修饰过程。例如，2-十一烷酮显著抑制了核糖体RNA（rRNA）的2’-O-甲基化和假尿嘧啶化修饰，而这些修饰对于核糖体的稳定性和功能至关重要。此外，编码核糖体亚基合成相关蛋白的基因，如 *Nop1*、*SNU13*、*NOP56* 和 *NOP58*，在两种处理组中均表现出下调趋势，这可能表明酮类化合物干扰了核糖体的组装过程，从而影响了 *Pd* 的蛋白质合成能力。

在DNA损伤修复方面，2-壬烷酮对 *Pd* 的DNA造成了直接损伤，进而激活了其DNA修复机制。具体来说，该化合物显著上调了编码DNA修复蛋白RAD52、复制蛋白A以及DNA连接酶和DNA聚合酶的基因。这些基因的表达变化表明， *Pd* 在面对2-壬烷酮的攻击时，启动了DNA损伤修复过程，以维持其遗传信息的完整性。而2-十一烷酮则对 *Pd* 的DNA修复能力影响较小，主要通过干扰细胞壁和细胞膜结构，以及影响能量代谢来发挥其抗真菌作用。

### 讨论与机制分析

从整体来看，这两种酮类化合物对 *Pd* 的影响是多方面的。它们不仅改变了细胞壁和细胞膜的结构，还干扰了能量代谢过程，并影响了遗传信息的处理。这些作用机制可能相互关联，共同导致 *Pd* 的生长抑制。例如，细胞壁和细胞膜的破坏可能导致细胞内容物的泄漏，进而引发细胞内的氧化应激反应。而氧化应激的加剧可能会进一步破坏细胞膜的完整性，导致细胞死亡。

在能量代谢方面，TCA循环是真菌细胞获取能量的重要途径。2-十一烷酮通过干扰这一循环的关键酶活性，可能直接导致 *Pd* 的能量供应不足，从而抑制其生长。此外，我们还发现，2-壬烷酮对ATP水解相关基因的上调可能表明其通过加速ATP的分解，干扰了 *Pd* 的能量代谢过程。

在遗传信息处理方面，核糖体的生物合成和RNA修饰是真菌维持其生命活动的重要环节。2-十一烷酮和2-壬烷酮均通过抑制这些过程，影响了 *Pd* 的蛋白质合成效率。这一发现可能解释了为什么这两种化合物能够显著抑制 *Pd* 的生长。

在DNA损伤修复方面，2-壬烷酮对 *Pd* 的DNA造成了直接损伤，这可能意味着该化合物具有某种直接的DNA破坏能力。这种破坏可能通过激活DNA修复机制来应对，但修复过程的效率可能不足以恢复DNA的完整性，从而导致细胞死亡。相比之下，2-十一烷酮对DNA的影响较小，主要通过其他途径实现其抗真菌效果。

### 应用前景与挑战

尽管这两种酮类化合物在实验室条件下表现出良好的抗真菌活性，但它们的实际应用仍面临诸多挑战。首先，实验室研究通常在特定的培养基上进行，而蝙蝠皮肤和洞穴环境可能具有不同的物理和化学特性，这可能影响酮类化合物的效果。因此，在将这些化合物应用于实际蝙蝠保护工作中之前，需要进一步评估其在自然环境中的稳定性和有效性。

其次，尽管这些化合物对真菌具有一定的抑制作用，但它们对非目标生物的影响也需要关注。例如，2-壬烷酮和2-十一烷酮对哺乳动物的毒性较低，但它们也可能对其他微生物或昆虫产生影响。因此，在设计使用方案时，需要考虑如何减少对非目标生物的干扰，例如采用局部喷洒的方法，以降低对生态系统的潜在负面影响。

此外，环境因素如洞穴内的温度和湿度也会影响酮类化合物的扩散和浓度。为了确保这些化合物能够有效作用于 *Pd*，需要在实际应用中对这些环境参数进行精确控制。同时，持续监测酮类化合物的浓度，以确保其在目标区域内的有效性和安全性，也是未来研究的重要方向。

### 结论

本研究通过转录组分析，揭示了2-壬烷酮和2-十一烷酮对 *Pd* 的多种生物学影响，包括细胞壁和细胞膜的损伤、能量代谢的干扰、以及DNA修复机制的激活。这些发现为探索新的抗真菌策略提供了理论依据，表明酮类化合物可能成为控制白鼻症的有效工具。然而，要将这些成果应用于实际保护工作中，还需要进一步研究其在自然环境中的效果，以及对非目标生物的影响。未来的研究应关注这些化合物在蝙蝠感染模型和实地模拟中的表现，以评估其作为新型抗真菌剂的可行性。此外，还需要探索如何优化其使用方法，以确保在不破坏生态环境的前提下，有效控制 *Pd* 的传播和感染。