灭活疫苗接种后Omicron突破性感染对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的免疫优势T细胞应答研究及其对JN.1变异株的交叉保护意义

本研究深入探讨了接种三剂灭活疫苗（BBIBP-CorV）后发生早期Omicron亚型突破性感染的个体对当前流行株JN.1核衣壳（N）蛋白的特异性T细胞免疫应答。研究发现，突破性感染可诱导强烈且功能多样的Th1/Tc1偏向型CD4+和CD8+T细胞反应，并鉴定出高度保守的免疫优势表位N-24（最小表位：PKDHIGTRNPANNA），其受HLA-DR限制。该研究为针对不断演变的SARS-CoV-2变异株的疫苗设计提供了关键的候选靶点，揭示了突破性感染如何重塑免疫优势格局，对理解长期免疫保护机制具有重要意义。

　　

研究背景与参与者

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情在全球范围内已持续数年，尽管疫苗的广泛接种显著降低了感染的发生率和严重程度，但病毒变异导致的免疫逃逸使得突破性感染（Breakthrough Infections）仍然广泛发生。特别是奥密克戎（Omicron）变异株，自2021年11月被世界卫生组织（WHO）报告以来，已衍生出包括BA.2.75、XBB、BA.5、BF.7、BA.2.86、JN.1等多个亚系，其中JN.1及其亚系是目前全球流行的主要变异株。

值得注意的是，与高度突变的刺突蛋白（Spike Protein）不同，核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）在奥密克戎各亚系间相对保守，氨基酸同源性达90%，这使其成为诱导交叉保护性T细胞应答的潜在关键靶点。先前的研究表明，接种灭活疫苗可诱导针对SARS-CoV-2结构蛋白（包括E、M、N和S蛋白）的T细胞应答，其中N蛋白和S蛋白是免疫优势抗原。然而，在突破性感染发生后，这些免疫优势表位图谱是否发生改变，以及能否对当前流行株（如JN.1）产生有效的T细胞应答，仍有待阐明。

为此，本研究招募了93名符合条件的参与者。所有参与者均已完成三剂次国产灭活疫苗BBIBP-CorV（基于武汉-Hu-1株）的全程接种，并在2022年12月至2023年11月期间（即JN.1变异株出现于中国之前）至少经历了一次奥密克戎亚型的突破性感染。研究排除了孕妇、哺乳期妇女、未成年人以及患有自身免疫性疾病、免疫缺陷、恶性肿瘤等基础疾病的个体，以确保研究人群的同质性和结果的可比性。

材料与方法

本研究采用了一系列先进的免疫学技术来深入解析T细胞应答。

首先，研究人员合成了两套分别覆盖武汉-Hu-1株和JN.1变异株N蛋白全长的重叠肽池（Overlapping Peptide Pool）。每套包含68条18氨基酸（18mer）的肽段，采用步进重叠策略（步长6aa，重叠12aa）设计，以确保覆盖整个蛋白的每一个区域。

从参与者外周血中分离出的外周血单个核细胞（PBMCs）在体外使用这些肽池进行刺激。随后，通过细胞内细胞因子染色（Intracellular Cytokine Staining, ICS）技术，利用流式细胞术（Flow Cytometry）检测抗原特异性的CD4⁺和CD8⁺ T细胞，并分析其分泌的细胞因子，包括干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-2 (IL-2)、IL-4和IL-10，以评估T细胞的功能表型（Th1/Tc1或Th2）和多功能性（Polyfunctionality）。

为了精准鉴定免疫优势表位（Immunodominant Epitopes），研究采用了先前建立的三维肽矩阵（Three-dimensional Peptide Matrix）筛选方法。将68条肽段分配至13个子肽池中，每个肽段出现在三个不同象限的池中。通过分析对哪些子池反应最强，可以反向推导出引起反应的单个优势肽段。

对于鉴定出的关键表位，研究进一步通过HLA抗体阻断实验（使用抗HLA-DP、-DQ和-DR的特异性抗体）来确定其HLA限制性。同时，通过合成一系列逐步截短的多肽（13mer和14mer）进行刺激实验，来精确绘制最小表位（Minimal Epitope）的核心序列。

此外，还利用生物信息学工具（如MEGA, ESPript, Weblogo）对关键表位在不同SARS-CoV-2变异株乃至其他人β属冠状病毒（如229E, OC43, SARS-CoV, HKU1, MERS-CoV, NL63）中的序列保守性进行了比对分析。

结果

针对JN.1变异株N蛋白的强大T细胞免疫

研究结果显示，在经历早期奥密克戎亚型突破性感染的个体中，针对当前流行株JN.1的N蛋白，能够 elicIT 出非常强劲的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答。

与针对祖先株武汉-Hu-1的N蛋白应答相比，针对JN.1 N蛋白的IFN-γ⁺、TNF-α⁺和IL-2⁺的CD4⁺和CD8⁺ T细胞频率显著更高。细胞因子分泌谱分析表明，这些JN.1特异的T细胞主要分泌IFN-γ和TNF-α，几乎不分泌IL-4和IL-10，呈现出明确的Th1（CD4⁺）和Tc1（CD8⁺）偏向表型，这是一种与抗病毒保护密切相关的功能表型。

进一步的多功能性分析（同时产生IFN-γ、TNF-α、IL-2中的一种、两种或三种）表明，针对JN.1和武汉-Hu-1的应答在多功能性特征上没有统计学差异，说明突破性感染虽然增强了应答的强度，但并未损害T细胞的多功能潜能。

这些发现有力地证明，早期的奥密克戎突破性感染能够诱导出强大的记忆T细胞库，这些细胞能够有效识别并应对当前流行的JN.1变异株，这可能对防止重症COVID-19至关重要。

免疫优势表位图谱的显著转变

通过三维矩阵筛选模型，研究人员系统性地绘制了在突破性感染个体中，针对JN.1 N蛋白的T细胞免疫优势表位图谱。

结果发现，与先前仅在接种疫苗的个体中表征的表位图谱相比，发生了显著的变化。多个包含氨基酸突变位点的新表位被识别出来。特别值得注意的是，之前在疫苗接种者中被鉴定为CD8⁺ T细胞优势表位的N-4和CD4⁺ T细胞优势表位的N-66，在突破性感染个体中不再维持其免疫优势地位。

取而代之的是，一个之前被认为是亚优势（Subdominant）的表位——N-24（对应N蛋白第139-156位氨基酸，序列为LNTPKDHIGTRNPANNAA）——脱颖而出，成为CD4⁺ T细胞最主要的攻击靶点。在57个测试样本中，有20个（35.1%）对其表现出优势应答。相比之下，CD8⁺ T细胞应答中未发现具有明显优势的单一表位。

为了排除肽池筛选可能存在的偏差，并直接验证先前表位在当前背景下的反应性，研究对15个先前鉴定出的优势表位（出现频率>1次）进行了单肽刺激实验。结果再次证实，只有N-24单肽能 consistently 诱导出强烈的CD4⁺ T细胞IFN-γ反应，而N-4和N-66则不能，这充分证明了突破性感染极大地改变了针对N抗原的免疫优势格局。

N-24表位的特征与保守性分析

N-24表位为何能成为新的免疫优势核心？序列比对分析提供了重要线索。

研究人员比较了武汉-Hu-1株与在中国JN.1出现之前流行的主要奥密克戎亚系（BA.2.75, XBB, BA.5, BF.7, BA.2.86, JN.1）在N-4、N-24和N-66表位上的氨基酸序列。发现N-4表位在所有奥密克戎变异株中均存在三个氨基酸的缺失突变，这很可能直接导致了其免疫原性的丧失。而N-24和N-66表位在这些变异株中则高度保守，序列未发生改变。

进一步将比较范围扩大到七种感染人的β属冠状病毒后，发现N-24表现出比N-66更高的序列保守性（相似性分别为33.33% 和 11.11%）。这种高度的保守性意味着，人体在遭遇其他普通冠状病毒（引起普通感冒）时激发的T细胞，可能对SARS-CoV-2的N-24表位存在交叉反应，这或许是其在反复抗原暴露后优势性被“重新唤醒”的原因之一。

更重要的是，对当前所有正在监测的JN.1亚系变异株（VUMs），包括KP.3、KP.3.1.1、XEC、LP.8.1、NB.1.8.1和XFG，N-24表位仍然保持完全保守。这预示着以其为靶点的T细胞应答可能对不断演变的病毒变异株提供广泛而持久的保护。

功能上，N-24特异性的CD4⁺ T细胞同样表现为Th1表型，主要分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等抗病毒细胞因子，进一步支持了其潜在的保护作用。

N-24表位的HLA限制与最小核心表位鉴定

明确抗原表位的HLA限制性和精确的最小序列，对于理解免疫识别机制和指导疫苗设计至关重要。

通过HLA II类抗体阻断实验，研究发现，在三名对N-24有优势应答的个体中，只有抗HLA-DR的抗体能够显著抑制CD4⁺ T细胞对N-24肽段的IFN-γ反应，而抗HLA-DP和抗HLA-DQ的抗体则无此效果。这明确地将N-24表位的呈递限制在了HLA-DR分子上。

接下来，为了精确定位N-24表位中被T细胞受体（TCR）直接识别的核心序列，研究人员合成了覆盖其全长的一系列截短肽：5条重叠的13mer肽和5条重叠的14mer肽。

刺激实验发现，在对全长N-18mer有强反应的样本中，无论是混合的还是单独的13mer肽，均无法有效刺激T细胞产生IFN-γ，提示最小表位长度可能大于13个氨基酸。而当使用14mer肽时，混合肽池能够成功激发反应。对26个以N-24为优势表位的样本进行精细筛选，发现其中14mer-4（序列为PKDHIGTRNPANNA）能够最频繁地（11/26）引起主导性应答。

因此，研究最终将N-24表位中的最小核心表位确定为PKDHIGTRNPANNA。尽管HLA-DR分子通常可以呈递9-30个氨基酸的肽段，但本研究确定的功能性表位为14聚体，推测这一长度在与HLA-DR结合（锚定）和与TCR相互作用（识别）之间达到了最佳平衡，从而表现出最强的免疫原性。

讨论

本研究系统阐述了在灭活疫苗免疫背景下发生奥密克戎突破性感染后，所诱导的针对流行JN.1变异株N蛋白的特异性T细胞免疫应答特征，并揭示了其免疫优势表位图谱发生的深刻变化。

最重要的发现之一是，高度保守的N-24表位取代了先前疫苗诱导的优势表位，成为CD4⁺ T细胞应答的新焦点。这种免疫优势格局的转变可能由多种因素共同驱动。其一，病毒变异直接导致原优势表位（如N-4）的缺失或改变，使其无法被原有的记忆T细胞有效识别。其二，抗原竞争（Epitope Competition）可能被解除。有理论认为，强免疫优势表位的存在会抑制对亚优势表位的应答；而当优势表位因突变而“沉默”后，亚优势表位（如N-24）便有机会脱颖而出。其三，N-24在β属冠状病毒间的较高保守性，可能使得由普通冠状病毒感染所建立的预存免疫（Pre-existing Immunity）被交叉激活（交叉反应），从而加强了对其的应答。当然，HLA结合亲和力、抗原加工效率、TCR库多样性等其他因素也共同塑造了最终的免疫优势 hierarchy。

本鉴定出的N-24最小表位（PKDHIGTRNPANNA）及其HLA-DR限制性，为开发针对广泛变异株的通用型T细胞疫苗或加强针疫苗提供了极具潜力的候选靶点。包含此类高度保守表位的疫苗，有望诱导出不易被病毒突变逃逸的、更持久广泛的T细胞免疫，成为对抗COVID-19的下一代策略。

研究的局限性包括：由于条件所限，未能设置接种疫苗后未发生感染的平行对照组进行直接比较，而是采用了同一批突破性感染个体对JN.1和武汉-Hu-1的应答进行横向比较；主要聚焦于T细胞免疫，未来研究可整合对中和抗体（Neutralizing Antibody）应答的全面分析，以提供更完整的免疫图谱；此外，对N-24表位的HLA限制性，未来可通过抗原呈递实验或测序方法提供更深入的机制证据。

结论

综上所述，本研究证实接种灭活疫苗后发生奥密克戎突破性感染，能够诱导出强大且功能多样的记忆T细胞，这些细胞能有效识别当前流行的JN.1变异株。更重要的是，突破性感染会显著重塑针对SARS-CoV-2 N蛋白的免疫优势表位图谱，其中高度保守的表位N-24跃升为CD4⁺ T细胞的主导性靶点。该发现深化了我们对感染免疫后机体适应性免疫应答动态演变的理解，并为设计基于保守表位的、具有广谱保护潜力的新型疫苗提供了重要的科学依据。