PV-10通过STING通路增强乙型肝炎疫苗接种的免疫应答

本研究揭示PV-10（10%玫瑰红溶液）作为新型STING激动剂，通过稳定STING二聚化、激活TBK1/IRF3/NF-κB信号轴，显著提升乙型肝炎疫苗的免疫原性，为疫苗无应答者提供创新解决方案。

　　

分子对接

通过AutoDock Vina 1.1.2程序进行分子对接分析，使用人源STING与amidobenzimidazole复合物的晶体结构（PDB ID: 6DXL）。玫瑰红（Rose Bengal, RB）与STING配体结合域（LBD）显示亲和力为-7.1 kcal/mol，属于中等结合强度。RB的V形结构与LBD口袋契合，通过疏水相互作用（如Tyr167和Tyr240的π-π堆积和卤素-π作用）及氢键（Thr263距离2.16 ?）稳定二聚体组装。Tyr240作为关键残基参与结合，其突变会破坏环二核苷酸（CDN）与STING的结合。

细胞培养

人急性单核细胞白血病细胞系THP-1购自ATCC，培养于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基。PLC/PRF/5肝癌细胞由曼尼托巴大学提供，培养于含10% FBS的DMEM。从健康志愿者外周血分离CD8⁺ T细胞和树突状细胞（DCs），培养于含细胞因子的完全RPMI培养基。研究经阿尔伯塔省健康研究伦理委员会批准（HREBA.CC-16–0286）。

免疫印迹

THP-1细胞以5×10⁵细胞/孔接种6孔板，分别用Vehicle对照、5 μM cGAMP或100 μM PV-10处理24小时。细胞裂解后，通过RIPA缓冲液提取蛋白，DC蛋白法定量。20 μg蛋白上样10%聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转膜至硝酸纤维素膜。膜用5% BSA封闭90分钟，一抗（1:1000稀释）4°C孵育过夜，二抗（1:3000稀释）室温孵育45分钟。ECL底物显影，ChemiDoc成像。抗体包括STING、TBK1、p-TBK1^Ser172、IRF3、p-IRF3^Ser396、NF-κB p65、p-p65^Ser536（Cell Signaling Technology）及β-actin（Thermo Fisher）。

免疫沉淀-质谱（IP-MS）

THP-1细胞用100 μM PV-10处理24小时，裂解后与STING抗体4°C孵育2小时，再加入Protein A珠过夜。免疫沉淀物通过SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色后切取~70 kDa条带，胰蛋白酶消化后肽段经纳米液相色谱-质谱联用分析。质谱数据通过Mascot算法检索数据库。

细胞因子和趋化因子分析

THP-1细胞用100 μM PV-10处理0–48小时，收集条件培养基，通过Eve Technologies的多重阵列分析细胞因子和趋化因子，包括CX3CL1、FLT-3L、G-CSF、GM-CSF、GRO-α、IFN-γ、IP-10/CXCL10、IL1-RA、IL-6、IL-8、IL-18、MCP-1和MCP-3。

IFN-γ ELISpot assay

从健康供体外周血分离PBMCs，通过Ficoll-Paque梯度离心。单核细胞通过塑料贴壁法分离，后用GM-CSF（100 ng/mL）和IL-4（25 ng/mL）诱导分化为DCs。DCs用HBV-1（TVELLSFLPSDFFPSV）或HBV-2（FLPSDFFPSV）肽段（50 μg/mL）脉冲过夜。CD8⁺ T细胞通过抗CD8磁珠分离，与脉冲DCs共培养5天（比例1:10），含IL-2（10 ng/mL）。预激的T细胞与PLC/PRF/5细胞（1:1比例）及5 μM PV-10共培养，通过IFN-γ ELISpot assay（R&D Systems）检测反应。图像通过EVOS M7000系统获取，ImageJ分析斑点形成细胞数。

RB与STING具有高结合亲和力

分子对接显示RB结合于STING的LBD口袋，与内源配体cGAMP占据相同位点。结合模式通过疏水相互作用（Tyr167 π-π堆积5.19 ?，Tyr240卤素-π作用3.92–4.88 ?）和氢键（Thr263 2.16 ?）稳定。氯代苯环深入LBD溶剂不可及区，三环结构通过氢键和疏水作用拉近两个单体，表明RB可作为STING激动剂促进二聚化。

PV-10诱导STING二聚化并激活通路

免疫印迹显示PV-10处理组出现高分子量STING条带，提示二聚体形成，而Vehicle和cGAMP组仅见单体。IP-MS进一步证实PV-10处理后STING二聚体富集。下游信号分子磷酸化水平分析表明，PV-10处理组p-TBK1^Ser172、p-IRF3^Ser396和p-p65^Ser536显著上调，与cGAMP效果相当，证实PV-10通过STING通路激活免疫信号。

PV-10上调免疫相关细胞因子和趋化因子

细胞因子分析显示PV-10处理48小时后，IL-6升高31倍，FLT-3L和IL-18分别升高7.4和4.5倍，G-CSF、GM-CSF和IL1-RA升高3–4倍，IFN-γ增加2倍。趋化因子中fractalkine（CX3CL1）升高31倍，MCP-1和IL-8分别升高6.5和5.9倍，IP-10升高4倍，GROα和MCP-3升高2.7–3.3倍。这些因子共同促进先天和适应性免疫应答。

PV-10增强预激CD8⁺ T细胞的IFN-γ分泌

ELISpot assay显示，HBV-1和HBV-2肽段预激的CD8⁺ T细胞在PV-10处理后，IFN-γ分泌显著增加（较Vehicle对照提高2倍以上）。HBV-1（长肽）本身诱导强反应，PV-10进一步增强；HBV-2（短肽）反应较弱，但PV-10仍可提升其应答。结果表明PV-10通过增强T细胞活性，提升对HBsAg阳性细胞的免疫识别。

讨论

STING蛋白含跨膜域（1–138残基）、LBD（139–336残基）和C端招募域（337–379残基）。配体结合后LBD发生内旋，暴露C端 motif，招募TBK1和IRF3。PV-10通过RB稳定STING二聚体，激活经典TBK1-IRF3通路和非经典NF-κB通路，诱导细胞因子（如IL-6、IL-18）和趋化因子（如IP-10、MCP-1）释放，促进DC成熟和T细胞活化。PV-10独特的二聚体稳定作用区别于传统CDN激动剂，且安全性良好（临床研究显示局部反应轻微）。本研究为PV-10作为HB疫苗佐剂提供机制依据，尤其针对疫苗无应答者（HLA多态性或先天免疫感应不足）。未来需在非应答者PBMCs中验证其转化潜力。