SEMA6D通过抑制NLRP3炎症小体活化及内质网应激调控巨噬细胞极化以缓解骨关节炎进程的机制研究

本综述深入探讨了SEMA6D在骨关节炎（OA）中的新型调控机制。研究揭示SEMA6D通过抑制NLRP3炎症小体活化及内质网应激，显著降低巨噬细胞向促炎M1表型极化，减少IL-1β、IL-6等炎症因子释放，从而有效缓解OA病理进展。该发现为OA的靶向治疗提供了新的理论依据和治疗策略。

　　

Abstract

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种影响全球超过5亿人的退行性关节疾病，其特征包括软骨降解、软骨下骨硬化以及滑膜炎。滑膜炎症是OA进展的关键驱动因素，主要由巨噬细胞极化和炎症小体活化所介导。本研究聚焦于Semaphorin 6D（SEMA6D）在巨噬细胞极化中的作用及其治疗潜力。通过转录组分析、体外及体内实验，发现SEMA6D过表达可下调ASC和NLRP3的表达，抑制巨噬细胞向促炎M1表型极化，并显著降低炎症介质如IL-1β和IL-6的水平。此外，SEMA6D还能减轻内质网应激，从而在OA大鼠模型中延缓疾病进展。

Introduction

OA的发病率不断上升，严重影响患者生活质量并加重医疗负担。滑膜炎在OA发展中扮演核心角色，炎症介质的释放加剧软骨基质降解，进而招募更多炎症细胞，形成恶性循环。滑膜由内膜衬里层（含巨噬细胞和滑膜细胞）和下衬层（结缔组织、血管及少量淋巴细胞）构成。在OA进程中，软骨碎片和坏死细胞释放的细胞内蛋白作为危险相关分子模式（DAMPs）激活滑膜巨噬细胞，触发下游信号通路如NLRP3炎症小体活化，导致IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟与分泌，从而加剧滑膜炎症。

SEMA6D是Semaphorin家族成员，既往研究多集中于神经系统发育，近年发现其参与多种生理病理过程，如视觉系统发育、乳腺细胞增殖迁移以及癌症进展。本团队前期工作证实SEMA6D作为miR-7的负调控因子，可调节软骨代谢、缓解OA进展，但其在免疫细胞特别是巨噬细胞炎症反应中的作用尚不明确。本研究旨在探讨SEMA6D对滑膜巨噬细胞极化的调控机制及其在OA治疗中的潜在价值。

Methods and Materials

Materials and Antibody

实验采用DMEM培养基和胎牛血清（Gibco）。所用抗体包括CD68、iNOS、NLRP3、ASC、CD80、IL-1β、IL-6、SEMA6D、ATF4、BIP-1、CHOP、IRE1α、Caspase-1、COX-2及β-actin等，购自Abcam、Proteintech和Santa Cruz等公司。

Cell Culture

小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院细胞库，于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养，条件为95%湿度和5% CO₂，达80–90%融合时传代。

Cell Transfections

使用Ribo Bio公司提供的pcDNA3.1 plasmid和siRNA，通过Lipo8000?转染试剂（Beyotime）对RAW264.7细胞进行转染，转染48小时后通过Western blot评估效率。

RNA Sequencing

对OE-SEMA6D（过表达）和Si-SEMA6D（敲低）组细胞进行转录组测序，采用trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，通过R包“clusterProfiler”识别差异表达基因（DEGs），设定fold change ≥ 2且调整后p值 < 0.05，并进行GO和KEGG富集分析。

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

使用trizol试剂提取RNA，SYBR Green PCR MasterMix（Applied Biosystems）进行qRT-PCR，以2^?ΔΔCt法计算基因相对表达量，β-actin作内参。

Flow Cytometry

RAW264.7细胞经LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）处理24小时后，通过流式细胞术（CyFlow Cube 6 2L4C）检测CD86表达。

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

采用Proteintech公司的IL-6和IL-1β ELISA试剂盒检测细胞上清液中的因子浓度，450 nm波长下读取吸光度。

Western Blot Analysis

使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定浓度，SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，一抗4°C过夜孵育，二抗37°C孵育2小时，化学发光法显影。

Immunofluorescence Staining

RAW264.7细胞接种于24孔板，分组处理后固定、透化、封闭，一抗4°C过夜孵育，二抗避光孵育2小时，DAPI封片，荧光显微镜成像。

Biological Transmission Electron Microscopy (BTEM)

细胞样品经2.5%戊二醛固定后，通过透射电镜（HT7800, HITACHI）观察细胞器变化。

Animal Model

15只雄性SD大鼠随机分为Sham组（假手术+生理盐水）、Control组（OA模型+生理盐水）和AVV6-SEM6D组（OA模型+AAV6-SEMA6D处理）。采用内侧半月板失稳（DMM）手术建立OA模型，所有操作符合中国实验动物管理规范和NIH指南，并经浙江大学动物实验中心伦理委员会批准。

Histological Analysis

膝关节样品经4% PFA固定、10% EDTA脱钙、石蜡包埋后，进行HE染色评估滑膜厚度和炎症等级，Safranin O-fast green染色评估软骨退化（OARSI评分），Masson染色评估滑膜纤维化，免疫荧光和免疫组化染色分析M1巨噬细胞极化和炎症。

Quantification and Statistical Analysis

数据以mean±SEM表示，GraphPad Prism V.7.0软件进行统计分析。正态分布数据采用t检验或ANOVA分析，非正态分布数据采用Mann–Whitney或Kruskal–Wallis检验，p<0.05为显著。

Results

The Upregulation of SEMA6D Inhibits the Polarization of M1 Macrophages and Downregulates the Expression of Endoplasmic Reticulum Stress-Related Genes

转录组分析显示，与pcDNA3.1-SEMA6D组相比，siRNA-SEMA6D处理组有213个基因上调和315个基因下调。蛋白互作分析表明，与巨噬细胞极化相关的基因（如Cdc20、Plk1和Ccnb1）在网络中起关键作用。差异基因主要富集于细胞内代谢过程，KEGG分析提示NOD样受体信号通路和TNF信号通路等炎症相关通路被激活。qRT-PCR结果显示，siRNA-SEMA6D组iNOS和IL-6表达较pcDNA3.1-SEMA6D组超过两倍，但TNFα无显著差异；NLRP3表达在siRNA-SEMA6D组更高；M2标志物显示SEMA6D不促进M2极化；内质网应激相关基因在siRNA-SEMA6D组显著上调。综上，SEMA6D上调可能通过减少内质网应激和NLRP3表达抑制M1巨噬细胞极化。

The Upregulation of SEMA6D Inhibits the Polarization of M1 Macrophages

LPS诱导炎症表型后，pcDNA3.1-SEMA6D处理显著降低iNOS表达，定量荧光显示其表达量仅为siRNA-SEMA6D组一半。ELISA检测显示SEMA6D上调减少巨噬细胞炎症因子分泌。qRT-PCR和Western blot结果一致表明SEMA6D表达抑制IL-1β、iNOS和IL-6基因及蛋白水平。这些发现提示SEMA6D可抑制巨噬细胞M1极化。

SEMA6D Inhibits M1 Polarization and Reduces the Release of Pro-Inflammatory Mediators by Suppressing the Expression of NLRP3

免疫荧光显示SEMA6D抑制促进NLRP3表达。流式细胞术分析M1标志物CD86，siRNA-SEMA6D组M1巨噬细胞比例（31.4%）高于pcDNA3.1-SEMA6D组（29.3%）和对照组（30.5%）。Western blot证实SEMA6D抑制NLRP3和caspase-1表达。表明SEMA6D通过下调NLRP3表达抑制巨噬细胞M1极化。

The Upregulation of SEMA6D Inhibits the Expression of ASC in Macrophages and Reduces the Release of Pro-Inflammatory Mediators

ASC与NLRP3炎症小体组装和活化密切关联。免疫荧光显示pcDNA3.1-SEMA6D组ASC表达低于其他组。ATP作为NLRP3激活剂显著增加NLRP3表达，但pcDNA3.1-SEMA6D与ATP联用抑制ATP诱导的NLRP3活化。流式、PCR和Western blot结果一致表明SEMA6D下调ASC表达，减少M1极化及炎症介质释放。

The Expression of SEMA6D Can Reduce Endoplasmic Reticulum Stress in Macrophages Under Inflammatory Conditions

内质网（ER）应激与炎症反应中巨噬细胞极化强相关。采用ER应激激活剂Thapsigargin（Th）处理RAW264.7细胞，显著上调ER应激标志物（ATF4、BIP-1、CHOP、IRE1α）。LPS+Th组这些蛋白表达明显增加，但LPS+Th+pcDNA3.1-SEMA6D组SEMA6D上调显著降低其水平。LPS+pcDNA3.1-SEMA6D组ER应激标志物甚至低于NC组。透射电镜图像显示Th+pcDNA3.1-SEMA6D组无ER扩张或空泡化，形态近似NC组。表明在炎症条件下，SEMA6D上调显著抑制ER应激。

The Expression of SEMA6D Delays the Progression of Osteoarthritis

OA大鼠模型组织学评估显示，OA组组织损伤严重，pcDNA3.1-SEMA6D组缺陷较轻。Safranin O-Fast Green和Masson染色表明OA组软骨结构降解、胶原破坏及潮线位移明显，AAV6-SEMA6D组破坏显著减轻，滑膜组织炎症浸润减少。免疫组化显示AAV6-SEMA6D组IL-6、iNOS和NLRP3阳性细胞数低于OA组。免疫荧光证实AAV6-SEMA6D组滑膜组织中M1巨噬细胞浸润减少，SEMA6D表达与M1标志物水平负相关。表明SEMA6D通过抑制M1巨噬细胞极化减轻滑膜炎，从而缓解OA进展。

Discussion

OA是一种常见致残性疾病，其确切发病机制未明。免疫细胞异常被确定为OA发展的关键介质。天然免疫是组织损伤后激活的第一道防线，尽管适应性免疫（尤其T细胞应答）在OA和类风湿关节炎（RA）滑膜炎中的作用已被广泛证实，但天然免疫是OA滑膜炎相关事件级联的起始因素。DAMPs通过与天然免疫细胞上的模式识别受体（PRRs）相互作用触发炎症应答。OA滑膜组织中浆细胞、M1和M2巨噬细胞、活化树突状细胞（DCs）和静止肥大细胞（MCs）显著增加，表明滑膜免疫稳态失衡是OA进展的关键因素。

本研究通过转录组测序发现，siRNA-SEMA6D处理的RAW264.7细胞中NOD样受体信号通路和TNF信号通路上调，qRT-PCR验证M1巨噬细胞标志物显著上调，且NLRP3和内质网应激相关基因激活。表型评估证实SEMA6D上调抑制巨噬细胞向促炎M1表型极化。机制探讨表明NLRP3和ASC是其下游靶点，SEMA6D过表达下调两者表达，抑制NLRP3炎症小体活化。此外，SEMA6D有效减轻炎症条件下的ER应激。大鼠OA模型验证SEMA6D上调降低滑膜组织M1巨噬细胞浸润和炎症因子水平，缓解OA进展。

尽管结果令人鼓舞，工作仍存在局限性。基因敲除和多性别动物实验将提供更可靠结果，加入人样本将增强研究成果的实际意义，这些需在后续研究中关注。

Conclusions

本研究发现SEMA6D是巨噬细胞极化的关键调控因子，通过抑制ASC介导的NLRP3炎症小体活化，阻断IL-1β等下游促炎介质释放，并减轻内质网应激及相关炎症。在OA大鼠模型中，SEMA6D上调降低滑膜组织M1巨噬细胞浸润和炎症因子水平，从而缓解OA进展。

Disclosure

作者声明无利益冲突。

Data Sharing Statement

支持本研究结果的数据可根据第一通讯作者的合理要求提供。